轉(zhuǎn)錄共激活因子p100蛋白對轉(zhuǎn)錄因子STAT1和STAT6基因轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控作用.pdf

1、研究目的：細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)的基本機(jī)制就是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑最終激活轉(zhuǎn)錄因子，并使相應(yīng)的基因表達(dá)和造成細(xì)胞行為的改變。JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是胞內(nèi)重要的信號通路之一，其在細(xì)胞生成、分化、凋亡等生物學(xué)方面有重要的意義，而其參與的調(diào)控需要多種轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。p100蛋白首先作為EBNA2(Epstein-Barr virus nuclear antigen2，EB病毒細(xì)胞核抗原2)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控激活因子被發(fā)現(xiàn)，研究表明p100蛋白是S

2、TAT6，STAT5的轉(zhuǎn)錄共激活因子，能增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性。STAT1與STAT6同屬于STAT家族，兩者存在高度相似性，p100是否也是STAT1的共激活因子呢？本課題對此作了研究，同時進(jìn)一步明確p100蛋白與STAT6在活細(xì)胞內(nèi)結(jié)合共定位情況，為進(jìn)一步研究p100蛋白的功能提供依據(jù)。 方法：本課題分三大部分進(jìn)行，第一部分是研究p100蛋白與STAT1或STAT6的相互結(jié)合作用。該部分從兩方面研究p100蛋白與STAT1或STA

3、T6的相互結(jié)合作用。其一是采用GST pull down技術(shù)來研究p100蛋白與STAT1或STAT6的體外結(jié)合作用，其二采用免疫共沉淀(CO-IP)研究p100蛋白與STAT1或STAT6的體內(nèi)結(jié)合作用；第二部分是采用蟲熒光素酶報(bào)告基因檢測p100蛋白及其片段調(diào)控STAT1或STAT6的轉(zhuǎn)錄活性；第三部分是觀察p100蛋白及其片段與STAT6的定位觀察。首先構(gòu)建以綠色或紅色熒光蛋白為報(bào)告基因的重組質(zhì)粒pEGFP-CI-STAT6和pE

4、RFP-CI-STAT6，其次轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞，經(jīng)刺激后在激光共聚焦顯微鏡下觀察融合蛋白的運(yùn)動變化。 結(jié)果： ①p100蛋白，p100-SN能夠與STAT6結(jié)合，但p100-TSN不能與STAT6結(jié)合。p100不能與STAT1結(jié)合。②蟲熒光素酶檢測到p100蛋白，p100-SN能夠增強(qiáng)STAT6的基因轉(zhuǎn)錄活性，但p100-TSN不能夠增強(qiáng)STAT6的基因轉(zhuǎn)錄活性。p100不能夠增強(qiáng)STAT1的基因轉(zhuǎn)錄活性。③成功構(gòu)

5、建質(zhì)粒pEGFP-CI-STAT1和pERFP-CI-STAT6，并能夠在HeLa細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)表達(dá)。在激光共聚焦顯微鏡下觀察到p100蛋白，p100-SN蛋白能夠在IL-4刺激下與STAT6共同進(jìn)入核內(nèi)，而p100-TSN不能相應(yīng)的進(jìn)入核內(nèi)。 結(jié)論： ①p100蛋白及其SN片段能夠與STAT6結(jié)合，并能夠增強(qiáng)STAT6的轉(zhuǎn)錄活性，而且呈劑量依賴性，TSN片段不能與STAT6結(jié)合，亦不能影響STAT6基因轉(zhuǎn)錄活性；p10

6、0蛋白不能與STAT1結(jié)合，且不能影響其轉(zhuǎn)錄活性。②成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-CI-STAT6和pERFP-CI-STAT6，并實(shí)現(xiàn)其在細(xì)胞中的表達(dá)。在激光共聚焦顯微鏡下觀察在活細(xì)胞狀態(tài)下蛋白的運(yùn)動情況，在IL-4刺激下，STAT6和p100蛋白能夠進(jìn)入核內(nèi)，p100-SN和STAT6也在同樣的條件下進(jìn)入核內(nèi)，提示它們在細(xì)胞內(nèi)存在共定位。而在IL-4刺激下，p100-TSN不能相應(yīng)的進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，提示與STAT6不存在共定位。③在IL