轉(zhuǎn)錄因子stat3調(diào)控激活態(tài)雪旺細(xì)胞基因表達(dá)的研究.pdf

1、引言:對周圍神經(jīng)損傷伴缺損的治療仍是外科領(lǐng)域的一個難題,目前主要是通過自體神經(jīng)移植進(jìn)行缺損段的修復(fù),這種治療方法本身存在一些不足。組織工程化人工神經(jīng)為周圍神經(jīng)缺損修復(fù)提供了新的手段,隨著組織工程材料研究的不斷發(fā)展和對于組織工程神經(jīng)認(rèn)識的不斷深入,使得組織工程化人工神經(jīng)的發(fā)展成為一個非常有前景的領(lǐng)域。而激活態(tài)雪旺細(xì)胞(activated Schwann cell ASC)作為一種優(yōu)良的組織工程種子細(xì)胞,具有高增值,高分泌某些神經(jīng)營養(yǎng)因子活

2、性,能夠有效促進(jìn)周圍神經(jīng)再生。對該細(xì)胞生物學(xué)活性的系統(tǒng)研究,是人工神經(jīng)研究的另一個熱點(diǎn)。本課題從轉(zhuǎn)錄因子、基因水平上對激活態(tài)雪旺細(xì)胞進(jìn)行研究,尋找激活態(tài)雪旺細(xì)胞優(yōu)于正常態(tài)雪旺細(xì)胞(normal Schwann cell NSC)的生物活性的原因。共分為三個部分:第一部分使用黑素細(xì)胞培養(yǎng)基改良成年大鼠雪旺細(xì)胞培養(yǎng)方法目的尋找簡單、快速獲得高純度雪旺細(xì)胞的方法。
　　方法:20只預(yù)變性一周的成年SD大鼠,重150克,取其坐骨神經(jīng),經(jīng)0

3、.25％胰酶,0.1%膠原酶分次酶消化30分鐘后。分別使用DMEM/F12培養(yǎng)基(A組)和黑素細(xì)胞培養(yǎng)基(B組)進(jìn)行培養(yǎng)。冷噴射(coldjet)方式傳代。S-100染色鑒定并計(jì)算雪旺細(xì)胞純度。結(jié)果:采用黑素細(xì)胞培養(yǎng)基組的雪旺細(xì)胞純度達(dá)到90%以上,細(xì)胞收獲量遠(yuǎn)高于采用DMEM/F12培養(yǎng)基的對照組。而對照組的雪旺細(xì)胞純度僅能保持在30%左右。結(jié)論:使用黑素細(xì)胞培養(yǎng)基及冷噴射傳代操作簡單,可以在短期內(nèi)獲得足量高純度的雪旺細(xì)胞。第二部分應(yīng)

4、用轉(zhuǎn)錄因子蛋白/DNA組合芯片檢測激活態(tài)/正常態(tài)雪旺細(xì)胞的活性轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平的差異目的檢測激活態(tài)/正常態(tài)雪旺細(xì)胞活性轉(zhuǎn)錄因子及其表達(dá)水平上的差異。方法應(yīng)用轉(zhuǎn)錄因子蛋白/DNA組合芯片技術(shù)檢測激活態(tài)/正常態(tài)雪旺細(xì)胞的活性轉(zhuǎn)錄因子。
　　結(jié)果:激活態(tài)雪旺細(xì)胞和正常態(tài)雪旺細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子芯片點(diǎn)陣圖顯示:激活態(tài)雪旺細(xì)胞與正常態(tài)雪旺細(xì)胞相比,有6個轉(zhuǎn)錄因子蛋白上調(diào)5倍以上,它們是PEPCK promoter GR、NF-E2(2)、Stat

5、3、NFE-6/CP1、PRDII-BF1和NFkB(2);這些表達(dá)顯著增加的轉(zhuǎn)錄因子,可能就是激活態(tài)雪旺細(xì)胞增殖活性高重要的原因;結(jié)論6個轉(zhuǎn)錄因子蛋白上調(diào)都與激活態(tài)雪旺細(xì)胞的快速分裂、高分泌狀態(tài)密切相關(guān)。第三部分染色質(zhì)免疫沉淀結(jié)合芯片技術(shù)檢測轉(zhuǎn)錄因子stat3調(diào)控激活態(tài)雪旺細(xì)胞/正常態(tài)雪旺細(xì)胞基因表達(dá)目的檢測轉(zhuǎn)錄因子stat3調(diào)控激活態(tài)雪旺細(xì)胞/正常態(tài)雪旺細(xì)胞哪些基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)ASC/NSC在基因表達(dá)水平的差異方法采用染色質(zhì)免疫沉淀

6、結(jié)合芯片技術(shù)對ASC/NSC基因組進(jìn)行高通量篩選結(jié)果經(jīng)過對ASC/NSC全基因組385,000個位點(diǎn)進(jìn)行掃描后,發(fā)現(xiàn)有361種基因在ASC/NSC中都與轉(zhuǎn)錄因子stat3發(fā)生結(jié)合。另有122種基因,僅在ASC中與stat3結(jié)合,而NSC中這些基因并不與stat3發(fā)生作用。其中的一些基因如:Atoh1、bex1、F2RL1、polg、Rcan2主要參與細(xì)胞周期、凋亡和成髓的調(diào)控。
　　結(jié)論:僅在ASC中與轉(zhuǎn)錄因子stat3發(fā)生作用的