結核分枝桿菌轉錄抑制因子SirR參與脅迫應答和轉錄調控.pdf

1、結核?。═uberculosis,TB）仍然威脅著全球人類的健康，2014年新增感染病例900萬，150萬人死于結核病，成為僅次于艾滋病的全球第二大傳染疾病(http://www.who.int/tb/publications/global_report/en/）。結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）是引起結核病的病原菌，它能夠在宿主巨噬細胞內持留，持留結核分枝桿菌可以逃避宿主免疫系統(tǒng)的殺傷作用以

2、及抗結核藥物。近年來，由于多重耐藥（multidrug-resistant，MDR）、廣泛耐藥（extensively drug-resistant，XDR）甚至是完全耐藥（totally drug resistant tuberculosis，TDR）MTB的出現(xiàn)，MTB與HIV共感染增加，再加上缺乏抗結核新藥和疫苗，結核病形勢變得更加嚴峻。因此，對于結核分枝桿菌致病機理的研究迫在眉睫。
　　結核分枝桿菌能夠通過多種機制逃逸宿主

3、免疫系統(tǒng)的殺傷，適應不利環(huán)境。除了細胞壁含有獨特的蠟質分枝菌酸，具有高度不透性，以及多種外排泵之外，結核分枝桿菌具有復雜的轉錄調控網(wǎng)絡。
　　金屬調控蛋白通過控制細菌中與金屬離子吸收，儲存和外排相關基因的表達，從而維持細菌金屬離子代謝的穩(wěn)定，其中DtxR（diphtheria toxin repressor）家族是最具有代表性的金屬調控蛋白之一。結核分枝桿菌中，DtxR家族包括兩個成員:IdeR（iron dependent re

4、pressor）和SirR（iron repressor），本課題主要以SirR為研究對象開展實驗。SirR最初發(fā)現(xiàn)于金黃色葡萄球菌，作為轉錄抑制因子，控制毒力基因的表達。結核分枝桿菌中，SirR由Rv2788編碼，由于SirR的轉錄調控依賴錳離子，并且調控與錳離子吸收相關的轉運蛋白，被重命名為MntR。
　　為了研究Rv2788蛋白在脅迫應答中的作用，我們分別構建了能夠表達Rv2788蛋白的重組恥垢分枝桿菌（Ms_Rv2788）

5、以及空載體重組恥垢分枝桿菌（Ms_Vec）。研究發(fā)現(xiàn)，Rv2788蛋白沒有影響重組恥垢分枝桿菌的生長速率，但改變了菌落形態(tài)。通過體外模擬恥垢分枝桿菌侵染巨噬細胞時面臨的壓力條件，發(fā)現(xiàn)Rv2788增強重組恥垢分枝桿菌的抗壓能力，對雙氧水、聯(lián)氨氧化壓力，SDS表面活性劑和酸性壓力更加耐受，同時增強了氯霉素、萬古霉素和阿米卡星處理后的存活能力。GC-MS分析細胞壁的脂肪酸組分，發(fā)現(xiàn)重組菌 Ms_Rv2788的脂肪酸成分明顯上調，特別是C14:

6、1w5(t)，C14:0和 C16:1w7(c)。通過檢測溴化乙錠和尼羅紅的積累，發(fā)現(xiàn) Rv2788蛋白降低了重組恥垢分枝桿菌細胞壁的通透性。這說明Ms_Rv2788可能通過改變細胞壁的脂肪酸組分降低細胞壁的通透性，進而增強對環(huán)境壓力以及抗生素的耐受能力。但是，我們發(fā)現(xiàn)了一個特殊現(xiàn)象：與空載菌相比，重組菌Ms_Rv2788對卷曲霉素更加敏感。熒光定量PCR檢測與卷曲霉素耐受相關基因的轉錄水平，發(fā)現(xiàn)Rv0039,Rv0812,Rv1286

7、三個基因的轉錄水平明顯下調，這表明Rv2788調控卷曲霉素耐受相關基因增強了恥垢分枝桿菌對卷曲霉素的敏感性。
　　此外，熒光定量PCR檢測了Rv2788的轉錄調控作用可能調控靶基因的轉錄水平，結果發(fā)現(xiàn)whiB1,Rv0077。Rv2221。Rv2986和Rv1219五個基因的轉錄水平下調，而SOS反應相關基因lexA則明顯上調表達。通過凝膠電泳實驗（EMSA）檢測到Rv2788能夠與上述下調基因的啟動子片段結合，這說明Rv2788

8、直接調控這些基因的轉錄水平。
　　綜上所述，本文主要研究了轉錄抑制因子Rv2788在壓力脅迫和轉錄調控中發(fā)揮的功能，首次報道了Rv2788可能直接或間接參與分枝桿菌脂肪酸代謝，改變細胞壁的脂肪酸成分和菌落形態(tài)，降低細胞壁的通透性，增強恥垢分枝桿菌的抗壓能力；調控卷曲霉素耐受相關基因的轉錄，增強恥垢分枝桿菌對卷曲霉素的敏感性；負調控多個基因，包括與細胞壁合成相關的基因whiB1和lexA。然而，Rv2788蛋白改變分枝桿菌細胞壁脂肪