重組Pin1蛋白的表達(dá),純化及其結(jié)晶.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、蛋白質(zhì)激酶Ser/Thr-Pro保守序列中Ser/Thr的可逆磷酸化是細(xì)胞各種生命活動(dòng)的重要信號(hào)調(diào)控機(jī)制,其失調(diào)將導(dǎo)致各種人類疾病的發(fā)生。Pin1是人類高度保守的特異性磷酸化肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶,它作用于脯氨酸所形成的肽鍵,并且僅使磷酸化pSer/Thr-Pro發(fā)生異構(gòu),即由順式變?yōu)榉词?,從而影響底物蛋白的功能。最近研究顯示:這種由Pin1介導(dǎo)的磷酸化蛋白構(gòu)象的改變是重要的細(xì)胞信號(hào)調(diào)控機(jī)制。目前,已有20多種Pin1的底物被分離出來,包

2、括Cdc25、Wee1、Myt1、Cdc27、CyclinD1和β-catenin等,與這些蛋白的相互作用說明Pin1可能在細(xì)胞周期調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要的作用。在癌癥病人體內(nèi)普遍發(fā)現(xiàn)Pin1過度表達(dá);此外,抑制Pin1的功能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,已有研究發(fā)現(xiàn)Pin1失調(diào)與阿爾茨海默氏病的神經(jīng)凋亡相關(guān)。 Pin1分子量為18KD,包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域:一個(gè)是由39個(gè)氨基酸殘基組成的N端WW區(qū),介導(dǎo)Pin1與磷酸化蛋白質(zhì)的結(jié)合;另一個(gè)

3、為C端的肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(PPIase)區(qū),由120個(gè)氨基酸殘基組成。對(duì)Pin1結(jié)構(gòu)的研究于1997年就有報(bào)導(dǎo),現(xiàn)階段對(duì)其結(jié)構(gòu)的研究主要集中于Pin1與短肽的相互作用的研究,而對(duì)于Pin1與生物底物的研究甚少。因此本論文選擇分別在Pin1兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的關(guān)鍵氨基酸W34和K63進(jìn)行突變,并對(duì)其進(jìn)行大量表達(dá)、純化。然后用懸吊液滴蒸汽擴(kuò)散法篩選出了Pin1-W34A和Pin1-K63A的結(jié)晶條件,并按照該條件得到成形晶體。通過X-Ray衍射

4、分析收集晶體相關(guān)數(shù)據(jù),研究結(jié)果顯示:Pin1-W34A晶體屬于P4(3)2(1)2空間群;Pin1-K63A晶體屬于P3(1)21空間群。同時(shí)還用圓二色譜分析了W34A及K63A突變位點(diǎn)的引入對(duì)Pinl蛋白整體構(gòu)象的影響,研究結(jié)果表明突變的引入并未引起Pin1蛋白構(gòu)象的顯著變化。同時(shí)本研究篩選Pin1與底物cdc25的復(fù)合物的結(jié)晶條件并獲得單晶。該研究為進(jìn)一步研究Pin1的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ),并為以后基于Pin1的新藥設(shè)計(jì)提供結(jié)構(gòu)理論依據(jù)

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