Bed3基因的克隆、表達及其表達產(chǎn)物Znf-bed3蛋白的純化和結(jié)晶.pdf

1、Znf-bed3 是一種新發(fā)現(xiàn)的蛋白，它具有鋅指結(jié)構，可以與Axin 相互作用從而正調(diào)控Wnt/β-catenin 信號通路。其基因序列已經(jīng)獲得并插入pET28a 質(zhì)粒得到Δ72a 質(zhì)粒。為了獲得高質(zhì)量的晶體以確定Znf-bed3 蛋白的結(jié)構，將Bed3基因于NdeⅠ和EcoRⅠ位點克隆入pET28c 質(zhì)粒，在BL21-CodonPlus(DE3)-RP菌株中表達目的蛋白，得到氨基端有組氨酸標簽的Znf-bed3 融合蛋白。超表達得到的

2、Znf-bed3 融合蛋白約占全菌蛋白的80％。 由于融合蛋白有組氨酸標簽，首先考慮使用鎳柱對目的蛋白進行分離純化，但是分離結(jié)果顯示此方法對分離目的蛋白有一定的局限性。表達得到的目的蛋白有80％以上以包涵體形式存在，所以希望使用變復性方法處理包涵體以得到高純度的目的蛋白。傳統(tǒng)的鹽酸胍變復性實驗中，目的蛋白復性效率很低十分低（最高僅能達到10％），不適合用于進行目的蛋白的分離，所以必須探索新的純化方案。由破菌一步開始進行，使用不同

3、破菌液和變性劑進行破菌和包涵體洗滌條件的優(yōu)化。實驗中發(fā)現(xiàn)，30％醋酸破菌液能夠很好的溶解包涵體，而且上清中目的蛋白相對純度較高，只過分子篩便可以得到純度達到結(jié)晶標準的蛋白。30％的醋酸極有可能會使蛋白產(chǎn)生酸變性，為了防止目的蛋白在醋酸溶液中變性而影響結(jié)晶過程，引入圓二色法比較此方法獲得的目的蛋白和鎳柱分離得到的目的蛋白的二級結(jié)構，結(jié)果顯示醋酸液中得到的目的蛋白二級結(jié)構與天然結(jié)構一致，可以用于進行結(jié)晶實驗。使用懸滴法對Znf-bed3 蛋