Bed3基因的克隆、表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物Znf-bed3蛋白的純化和結(jié)晶.pdf

1、Znf-bed3 是一種新發(fā)現(xiàn)的蛋白，它具有鋅指結(jié)構(gòu)，可以與Axin 相互作用從而正調(diào)控Wnt/β-catenin 信號(hào)通路。其基因序列已經(jīng)獲得并插入pET28a 質(zhì)粒得到Δ72a 質(zhì)粒。為了獲得高質(zhì)量的晶體以確定Znf-bed3 蛋白的結(jié)構(gòu)，將Bed3基因于NdeⅠ和EcoRⅠ位點(diǎn)克隆入pET28c 質(zhì)粒，在BL21-CodonPlus(DE3)-RP菌株中表達(dá)目的蛋白，得到氨基端有組氨酸標(biāo)簽的Znf-bed3 融合蛋白。超表達(dá)得到的

2、Znf-bed3 融合蛋白約占全菌蛋白的80％。 由于融合蛋白有組氨酸標(biāo)簽，首先考慮使用鎳柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行分離純化，但是分離結(jié)果顯示此方法對(duì)分離目的蛋白有一定的局限性。表達(dá)得到的目的蛋白有80％以上以包涵體形式存在，所以希望使用變復(fù)性方法處理包涵體以得到高純度的目的蛋白。傳統(tǒng)的鹽酸胍變復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，目的蛋白復(fù)性效率很低十分低（最高僅能達(dá)到10％），不適合用于進(jìn)行目的蛋白的分離，所以必須探索新的純化方案。由破菌一步開始進(jìn)行，使用不同

3、破菌液和變性劑進(jìn)行破菌和包涵體洗滌條件的優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，30％醋酸破菌液能夠很好的溶解包涵體，而且上清中目的蛋白相對(duì)純度較高，只過(guò)分子篩便可以得到純度達(dá)到結(jié)晶標(biāo)準(zhǔn)的蛋白。30％的醋酸極有可能會(huì)使蛋白產(chǎn)生酸變性，為了防止目的蛋白在醋酸溶液中變性而影響結(jié)晶過(guò)程，引入圓二色法比較此方法獲得的目的蛋白和鎳柱分離得到的目的蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示醋酸液中得到的目的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)與天然結(jié)構(gòu)一致，可以用于進(jìn)行結(jié)晶實(shí)驗(yàn)。使用懸滴法對(duì)Znf-bed3 蛋