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文檔簡介
1、研究背景:Urofacial(Ochoa)綜合征(UFS)是一種罕見的常染色體隱性遺傳病。通過家系連鎖分析及染色體外顯子測序,HPSE2缺陷被證明是UFS的致病基因,但其機制還不完全清楚,對該基因的功能也多局限于生物信息學預(yù)測。
目的:利用生物信息學預(yù)測,HPSE2為分泌型蛋白可能性大,其N端38個氨基酸為分泌信號肽。本研究以EGFP為表達及鑒定標簽,驗證HPSE2基因在哺乳動物細胞內(nèi)是否為分泌表達。
方法:利用重組
2、PCR技術(shù),在EGFP基因5′端加入包含有HPSE2分泌信號肽的CDS區(qū)(1~588bp),構(gòu)建為HPSE2-EGFP-partial融合基因;構(gòu)建5′端融合IgGκ分泌信號肽的EGFP融合基因IgGκ-EGFP,將兩種融合基因克隆到哺乳動物表達載體pcDNA3.1(+)上,構(gòu)建成pcDNA3.1(+)-HPSE2–EGFP-partial和pcDNA3.1(+)-IgGκ-EGFP表達質(zhì)粒。以pEGFP-C3作為胞漿表達對照,pcDN
3、A3.1(+)-IgGκ-EGFP作為分泌表達對照,pEGFP-N1-HPSE2為陽性對照,并利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人胚腎Hek293T細胞,通過熒光顯微鏡及Western檢測重組基因表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)外的分布。
結(jié)果:經(jīng)酶切、PCR及測序鑒定,重組表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-HPSE2-EGFP-partial和pcDNA3.1(+)-IgGκ-EGFP構(gòu)建成功,經(jīng)熒光顯微鏡及Westernblot檢測,證實HPSE2基因的表達產(chǎn)
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