HSV-2的糖蛋白D與hIL-2cDNA融合基因表達(dá)產(chǎn)物的純化及重組桿狀病毒載體的構(gòu)建.pdf

1、　　本研究的目的：在前階段工作的基礎(chǔ)上，以原核表達(dá)系統(tǒng)為主，優(yōu)化表達(dá)體系及表達(dá)條件，用親和層析的方法，純化出可溶形式的目的蛋白。嘗試構(gòu)建桿狀病毒表達(dá)載體(BAC-TO-BAC)，期望獲得溶解性更好、活性更接近于天然狀態(tài)的目標(biāo)蛋白質(zhì)，為下一步的動(dòng)物免疫工作提供有活性的免疫原。 材料與方法1.構(gòu)建重組表達(dá)載體，依據(jù)融合基因gD2-hIL-2全長(zhǎng)序列，保留gD2基因的信號(hào)肽，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，PCR法擴(kuò)增目的基因。雙酶切擴(kuò)增片段和表

2、達(dá)載體，酶切產(chǎn)物連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入克隆菌株，篩選陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒，PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定，應(yīng)用電腦軟件，分析融合基因。2.目的蛋白的表達(dá)與優(yōu)化,重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入工程菌，隨機(jī)挑選克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE和Westernblot法檢測(cè)。陽(yáng)性克隆菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)，對(duì)細(xì)胞各組分進(jìn)行SDS-PAGE分析，判斷可溶性。改變溫度、IPTG濃度，不同條件下誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，對(duì)胞質(zhì)可溶組分進(jìn)行SDS-PAGE分析，摸索

3、最佳表達(dá)條件。3.目標(biāo)蛋白質(zhì)純化,將單個(gè)轉(zhuǎn)化菌擴(kuò)大培養(yǎng)，以最佳條件誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體，超聲波裂解，收集上清液。選用His-Bind親和純化試劑盒，經(jīng)結(jié)合、漂洗和洗脫等步驟，分離融合蛋白，用特異性蛋白酶將標(biāo)簽切掉，得到純化的目的蛋白。SDS-PAGE和Westernblot法檢測(cè)純化效果。標(biāo)定最終體積、濃度，保存目的蛋白備用。4.重組桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建雙酶切原核重組體和桿狀病毒供體質(zhì)粒，將融合基因亞克隆入供體質(zhì)粒，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)