UL27、UL29基因shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)HSV-2的干擾效應(yīng)研究.pdf

1、目的：以Ⅱ型單純皰疹病毒(Herpes simplex virus type2，HSV-2)UL27、UL29為靶基因，構(gòu)建短發(fā)夾RNA(small hairpin RNA，shRNA)重組表達(dá)載體，在體外細(xì)胞水平上觀察HSV-2 UL27，UL29單個(gè)靶向shRNA表達(dá)載體對(duì)病毒抑制的能力，以及聯(lián)合干擾兩個(gè)靶向shRNA表達(dá)載體對(duì)HSV-2復(fù)制的影響。
　　 方法：針對(duì)HSV-2 UL27、UL29基因各篩選出4條擬干擾靶位點(diǎn)

2、，分別構(gòu)建4組抑制UL27、UL29基因的短發(fā)夾RNA的真核表達(dá)載體，以及不針對(duì)任何序列的陰性表達(dá)載體shRNA NC。通過脂質(zhì)體介導(dǎo)重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，48小時(shí)后再接種HSV-2。篩選出具有干擾作用的shRNA，進(jìn)行聯(lián)合干擾。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)UL27各組、UL29各組及UL27+UL29組的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，終點(diǎn)滴定法檢測(cè)細(xì)胞上清液中的各組病毒滴度，蛋白印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)效果。
　　 結(jié)果：(1)酶

3、切后電泳鑒定重組表達(dá)載體pGPU6/Neo-UL27、pGPU6/Neo-UL29和陰性表達(dá)載體shRNA NC；(2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與空白組(未轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體)比較，shRNA NC、UL27shRNA75組、UL27shRNA151組、UL27shRNA963組、UL27shRNA2265組抑制率分別為6.05％、75.17％、35.38％、30.74％、60.22％，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比均具有顯著性差異(P<0.0

4、5)，shRNA NC與對(duì)照組相比無顯著性差異；與空白組比較UL29shRNA897組、UL29shRNA939組、UL29shRNA1461組、UL29shRNA1653組抑制率分別為28.80％、59.95％、66.08％、36.27％，均具有顯著性差異(P<0.05)，其中以UL29shRNA1461組效果為最佳。UL27shRNA75聯(lián)合UL29shRNA1461聯(lián)合干擾組抑制率達(dá)到91.28％，(與空白組比較)具有顯著性差異(

5、P<0.05)。(3)終點(diǎn)滴定法結(jié)果顯示UL27shRNA75組、UL27shRNA151組、UL27shRNA963組、UL27shRNA2265組、UL29shRNA897組、UL29shRNA1461組和UL27shRNA75與UL29shRNA1461聯(lián)合干擾組可不同程度降低上清液中的病毒感染滴度，與空白組比較差異性顯著(P<0.01)。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建pGPU6/Neo-UL27、pGPU6/Neo-UL29重組