鴨腸炎病毒UL15及UL41基因的鑒定.pdf

1、鴨腸炎病毒(DEV),又稱鴨皰疹病毒Ⅰ型,是鴨、鵝及天鵝等雁形目水鳥的一種重要病原體,可引起急性、接觸性傳染的鴨病毒性腸炎(7DVE),該病在家養(yǎng)及野生水禽中可造成高死亡率及產(chǎn)蛋下降。DEV基因組DNA序列的測(cè)定工作直到最近2年才陸續(xù)完成,而其編碼基因的確定大多僅停留在與其他皰疹病毒同源基因的序列分析基礎(chǔ)上,對(duì)蛋白編碼基因的探索有助于我們更好地了解該病毒的生物學(xué)特征。為此,本研究開展了DEV UL15和UL41基因及其編碼蛋白的鑒定和分

2、析工作。
　　 DEV UL15由2個(gè)外顯子和1個(gè)3.5 kb的內(nèi)含子組成,其編碼序列可轉(zhuǎn)錄2個(gè)轉(zhuǎn)錄本:全長(zhǎng)的UL15及N-末端截?cái)嗟腢L15.5。2.9 kb的UL15轉(zhuǎn)錄本編碼一739個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),其分子量大小約為82 kDa,而UL15.5轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)約1.3 kb,包含888 bp的ORF,該ORF編碼一大小約為32 kDa的多肽。序列分析表明UL15編碼序列在皰疹病毒科內(nèi)高度保守,并且含有2個(gè)在皰疹病毒及噬菌體末端酶催

3、化亞基序列中保守的Walker A(261 VPRRHGKT267)和Walker B(54LLFVDE3591)基序?；?3個(gè)皰疹病毒UL15的氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明DEV與α皰疹病毒亞科,Mardivirus病毒屬內(nèi)病毒親緣關(guān)系較近。此外,DEV UL15的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)對(duì)放線菌酮(CHX)和膦乙酸(PAA)均敏感,說明UL15在DEV復(fù)制過程中晚期表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示,抗UL15C232的抗血清可在DEV感

4、染的細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到UL15和UL15.5的表達(dá),而在純化的病毒粒子中檢測(cè)不到蛋白的存在。間接免疫熒光結(jié)果顯示,在感染早期(6 hpi)UL15定位在CEF細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,到12 hpi和24 hpi時(shí)則轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核,而在無其他病毒蛋白參與下,UL15則滯留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。
　　 UL41的同源蛋白編碼病毒宿主關(guān)閉蛋白(VHS),可非特異性的降解宿主及病毒mRNA。PSI-BLAST搜索顯示,DEV UL41氨基酸序列具有核酸酶家族蛋

5、白特征,且模擬的3D空間結(jié)構(gòu)也與T4 RNase H和Taq DNA聚合酶的活性區(qū)域很好的疊合。此外,基于UL41氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)DEV與Mardivirus內(nèi)病毒親緣關(guān)系較近。
　　 為進(jìn)一步分析編碼蛋白特性,將UL41 ORF克隆至表達(dá)載體pMAL-c4x中,原核表達(dá)了可溶性全長(zhǎng)融合蛋白MBP-UL41,并制備了抗UL41的抗血清。隨后的體外VHS活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn),融合蛋白具有RNase活性。CEF細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)表

6、達(dá)的UL41可致共轉(zhuǎn)染的報(bào)告基因Luc表達(dá)量降低,證實(shí)了細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的UL41蛋白的RNase活性。此外,時(shí)序性分析發(fā)現(xiàn)UL41基因的表達(dá)對(duì)CHX敏感,而對(duì)PAA不敏感,說明UL41是早期表達(dá)基因。
　　 Western blot結(jié)果顯示,DEV感染的細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)到UL41蛋白的存在,DEV病毒粒子中也含有UL41蛋白。在DEV感染的CEF細(xì)胞內(nèi),UL41定位在細(xì)胞質(zhì)的核周區(qū)域,感染早期呈顆粒性聚集分布。在pcDNA-UL41轉(zhuǎn)染