28490.應用rna干擾技術抑制人巨細胞病毒ul122、ul54基因體外表達的研究

1、浙江大學醫(yī)學院博士學位論文應用RNA干擾技術抑制人巨細胞病毒UL122、UL54基因體外表達的研究姓名：段群軍申請學位級別：博士專業(yè)：臨床醫(yī)學指導教師：尚世強張澤偉20100401浙江人學博十學位論文中文摘要AD293細胞，應用實時熒光定量PCR、流式細胞檢測技術和倒置熒光顯微鏡從mRNA和蛋白質水平篩選出理想、高效的siRNA作用靶位。(4)慢病毒載體構建及轉染：參照上述篩選出的高效siRNA作用靶位，構建能夠表達shRNA的慢病毒載

2、體，并將此慢病毒載體和融合蛋白表達載體轉染細胞，應用流式和WesternBlot法檢測shRNA的慢病毒表達載體對HCMV目標基因體外表達的抑制作用。結果(1)本研究成功構建融合蛋白表達載體pULl22EGFP和pUL54EGFP，實現(xiàn)ULl22基因和UL54基因的體外表達。該融合蛋白表達載體在轉染后24小時和48小時均能表達綠色熒光，但是轉染后48小時表達的綠色熒光明顯強于轉染后24小時表達的綠色熒光。(2)成功將d段設計合成好的、具

3、有形成shRNA能力的DNA序列插入pAVU627質粒載體U6啟動子的下游，構建成具有表達shRNA能力的重組質粒載體，分別命名為psiULl221、psiULl222、psiULl22—3、psiUL541、psiUL542和psiUL54—3。(3)將融合蛋白表達載體pULl22EGFP分別與shRNA表達載體psiULl22—1、psiULl22—2和psiULl223共轉染。倒置熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)轉染后24h重組質粒載體psiUL

4、l22一l、psiULl222和psiULl22—3對融合蛋白的表達無明顯抑制作用，轉染后48hpsiULl221和psiULl22—2對融合蛋白熒光表達具有明顯抑制作用，而psiULl223對融合蛋白熒光表達只有輕度抑制作用流式(FCM)結果顯示轉染后48hpsiULl22一l、psiULl222和psiULl22—3對融合蛋白的抑制率分別為820a：10％、79525％和53525％，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P005)，且ps