人巨細胞病毒潛伏感染相關(guān)基因UL138轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件鑒定及功能研究.pdf

1、目的：人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)先天感染危害巨大，并引起免疫抑制患者致死性感染。其危害主要來自于潛伏病毒在孕期及免疫缺陷等特定時期的再激活。搞清病毒潛伏狀態(tài)維持及再激活機制并建立有效的病毒再激活控制手段是預(yù)防HCMV危害的關(guān)鍵。目前，已經(jīng)證明HCMV潛伏感染過程中UL138基因處于高表達狀態(tài)，并與病毒潛伏感染的形成與維持密切相關(guān)。UL138基因位于與HCMV病毒致病密切相關(guān)的UL/b'區(qū)，在臨床

2、株或低傳代分離株中具有潛伏感染特性。在不同細胞環(huán)境下，UL138可在活動性感染或潛伏感染時相均可表達。UL138轉(zhuǎn)錄本是多順反子結(jié)構(gòu)，所表達的蛋白有利于病毒的潛伏感染。目前有關(guān)pUL138的轉(zhuǎn)錄調(diào)控已有研究報道，但有關(guān)UL138基因具體轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制尚不清楚。本研究對UL138基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制進行了研究，有助于闡明UL138在HELF細胞感染中高表達機制。
　　方法：采用熒光素酶報告基因表達檢測實驗及競爭性電泳遷移率變動分析實驗(

3、electrophoretic mobility shift assay，EMSA)篩選鑒定UL138基因上游有啟動子活性的核心序列和其相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，BAC技術(shù)構(gòu)建調(diào)控序列缺失突變株研究啟動子活性區(qū)的功能并用Northern blot技術(shù)檢測啟動子缺失對UL138基因1.4kb轉(zhuǎn)錄本表達的影響，通過Western blot方法檢測在HCMV感染的HELF細胞中Ap-1蛋白表達水平的變化，繪制了HCMV Han BAC在轉(zhuǎn)染與該調(diào)控序列

4、結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子Activator protein1(Ap-1) siRNA以及模擬轉(zhuǎn)染空脂質(zhì)體的HELF細胞和HCMV Han-BAC/△UL138p感染HELF細胞中的病毒生長曲線驗證鑒定出的調(diào)控序列對病毒復(fù)制的影響。
　　結(jié)果：⑴應(yīng)用pGL3熒光素酶報告載體，采用5'端缺失突變技術(shù)構(gòu)建UL138基因5'非編碼區(qū)不同序列的熒光素酶報告載體，確定了一個33bp的正調(diào)控元件。構(gòu)建異源啟動子質(zhì)粒證實調(diào)控元件對其具有調(diào)控作用，啟動子活性

5、。⑵競爭性EMSA實驗發(fā)現(xiàn)HELF和Thp-1細胞核蛋白中含有正調(diào)控序列的特異性結(jié)合蛋白，正調(diào)控序列區(qū)存在轉(zhuǎn)錄因子Ap-1的結(jié)合位點，并與之特異性結(jié)合。⑶BAC技術(shù)成功構(gòu)建UL138基因上游調(diào)控序列缺失突變株Han BAC/△UL138p，Northernblot檢測出缺失啟動子調(diào)控序列區(qū)及用siRNA干擾轉(zhuǎn)錄因子Ap-1后UL138基因1.4kb轉(zhuǎn)錄本的表達減少。⑷Western blot結(jié)果表明在HCMV感染的HELF細胞中，Ap-

6、1蛋白表達在24小時增加，隨感染時間延長，表達水平減少。⑸病毒生長曲線結(jié)果顯示滴度在接毒后24-72小時3組相比區(qū)別不明顯。而隨著感染時間延長到96小時，HCMV Han-BAC/△UL138p的病毒滴度是Han-BAC的2.5倍，而與轉(zhuǎn)染siRNA of AP-1后感染Han-BAC無明顯差異。
　　結(jié)論：①通過熒光素酶報告基因檢測技術(shù)證實了UL138基因1.4kb轉(zhuǎn)錄本上游非編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性，確定了一個33bp有啟動活性的正調(diào)