人巨細(xì)胞病毒潛伏激活診斷試劑盒的研制和相關(guān)研究.pdf

1、目的:制備人巨細(xì)胞病毒pp65抗原血癥檢測(cè)試劑盒，并對(duì)pp65蛋白在外周血白細(xì)胞內(nèi)的定位及意義進(jìn)行探討。建立檢測(cè)HCMV pp65抗體的間接ELISA方法。 方法:以重組表達(dá)的HCMV pp65蛋白為抗原，運(yùn)用雜交瘤技術(shù)制備單抗，對(duì)篩選獲得的單抗進(jìn)行鑒定，并以間接免疫熒光法與進(jìn)口同類產(chǎn)品進(jìn)行比較；將自制小鼠IgG免疫家兔獲得的二抗進(jìn)行標(biāo)記，獲得完整的檢測(cè)試劑盒，以間接免疫熒光法與進(jìn)口同類產(chǎn)品進(jìn)行比較；通過(guò)DAPI染色、間接免疫熒

2、光法和共聚焦顯微鏡掃描三者結(jié)果共同確定HCMV pp65 蛋白在細(xì)胞中的定位，并對(duì)部分移植患者進(jìn)行動(dòng)態(tài)跟蹤；以重組表達(dá)蛋白HCMV pp65為抗原，建立間接ELISA法檢測(cè)其特異性IgG型抗體，并對(duì)不同人群的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。 結(jié)果:獲得3株針對(duì)HCMV pp65蛋白的單抗，即B6、G12、2B12；Ig亞型依次為IgG1k型、IgG1k型、IgMk型；親合常數(shù)依次為3.6×107L/mol、3.8×107L/mol、3.1×1

3、08 L/mol。免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果表明3株單抗都與HCMV pp65蛋白特異性的結(jié)合，除2B12外，B6、G12與EBV、HSV 1、HSV 2均無(wú)交叉反應(yīng)；與進(jìn)口單抗平行檢測(cè)140份臨床標(biāo)本，結(jié)果一致。與自行標(biāo)記異硫氰酸熒光素的二抗配套檢測(cè)HCMV pp65抗原，并以免疫熒光檢測(cè)法與進(jìn)口同類產(chǎn)品進(jìn)行比較，通過(guò)與進(jìn)口同類試劑盒平行檢測(cè)16份臨床標(biāo)本，結(jié)果一致；結(jié)合DAPI染色、間接免疫熒光法和共聚焦顯微鏡掃描結(jié)果，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞有胞漿陽(yáng)性

4、、胞核陽(yáng)性和核漿陽(yáng)性3種表現(xiàn)形式，對(duì)于胞核陽(yáng)性的細(xì)胞，pp65蛋白主要定位在細(xì)胞核內(nèi)，非核膜部分；間接ELISA法檢測(cè)HCMV pp65-IgG的最佳包被抗原濃度為10ng/孔，酶標(biāo)二抗的工作濃度為1:3000。當(dāng)陽(yáng)性判斷值A(chǔ)為0.298時(shí)，87份不同組的血清標(biāo)本（HCMV感染活動(dòng)組、HCMV感染不活動(dòng)組、HCMV未感染組）陽(yáng)性檢出率分別為51.6％、12.1％和0。三組兩兩間均存在顯著性差異（P<0.01）。 結(jié)論:自制檢測(cè)試