動物衣原體分子檢測方法研究和診斷試劑盒的研制及應(yīng)用.pdf

1、衣原體病是由各類衣原體感染人類、哺乳動物、禽類以及節(jié)肢昆蟲所引起的一類重要疾病，有些衣原體病為人畜共患傳染病。衣原體革蘭氏染色陰性，嚴格細胞內(nèi)寄生。目前，衣原體科分為衣原體和嗜衣原體兩個屬。衣原體屬包括沙眼衣原體、鼠衣原體、豬衣原體；嗜衣原體屬包括肺炎嗜衣原體、家畜嗜衣原體、鸚鵡熱嗜衣原體、流產(chǎn)嗜衣原體、豚鼠嗜衣原體和貓嗜衣原體。衣原體引起人類和動物多種疾病，沙眼衣原體、肺炎嗜衣原體和鸚鵡熱嗜衣原體感染人類及各種動物；家畜嗜衣原體、流產(chǎn)

2、嗜衣原體和豬衣原體主要感染家畜和某些野生動物。因此，本病具有十分重要的公共衛(wèi)生和經(jīng)濟意義，建立快速準確的鑒別診斷方法對衣原體病預(yù)防和控制尤為重要。
　　 本論文基于衣原體的主要外膜蛋白基因(ompA)開發(fā)針對豬衣原體(C.suis)、流產(chǎn)嗜衣原體(Ch.abortus)及肺炎嗜衣原體(Cpn)的多重套式PCR(nested multiplex polymerase chain reaction assay，nmPCR)檢測方法及

3、試劑盒，衣原體熒光定量PCR檢測方法和LAMP檢測方法。并應(yīng)用nmPCR試劑盒對青海某羊場和重慶地區(qū)種豬場進行了衣原體病的流行病學(xué)研究。獲得以下研究結(jié)果：
　　 (1)本文建立了衣原體科特異PCR檢測方法以及流產(chǎn)嗜衣原體、豬衣原體和肺炎嗜衣原體的單管同步分型的多重套式PCR(nmPCR)檢測方法。在nmPCR首輪擴增中，可以擴增出衣原體科特異性的1100 bp核酸片段。在此基礎(chǔ)上，第二輪nmPCR擴增獲得種特異性擴增片段：流產(chǎn)嗜

4、衣原體340 bp，豬衣原體526 bp和肺炎嗜衣原體267 bp。該方法具有靈敏度高和特異性的特點，與改良DNA提取方法相結(jié)合，可以有效實現(xiàn)對細胞培養(yǎng)物、豬、綿羊和山羊鼻咽拭子、糞拭子及組織樣品中三種衣原體同時進行檢測。
　　 (2)本文研發(fā)了與豬衣原體、流產(chǎn)嗜衣原體及肺炎嗜衣原體的單管同步分型的多重套式PCR檢測方法相匹配的標準化檢測試劑。通過穩(wěn)定性試驗和實驗室間驗證試驗，證明了該檢測試劑盒具有良好穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

5、　　 (3)本研究建立了衣原體的實時定量PCR檢測方法，靈敏度高，特異性強。最低可以檢測200拷貝/μL質(zhì)粒DNA，可用于衣原體的診斷和流行病學(xué)調(diào)查。
　　 (4)本文基于ompA基因，建立了衣原體科LAMP檢測方法。該方法具有特異性強、靈敏度高及實驗條件要求較低的特點，可以在水浴鍋中完成，在添加了鈣黃綠素后，陽性的LAMP擴增反應(yīng)呈現(xiàn)明顯的黃綠色，使檢測結(jié)果的非常直觀，容易判讀。本法適宜于臨床上對衣原體病進行現(xiàn)場快速篩查，但