牛乳中鏈霉素殘留檢測ELISA試劑盒的研制.pdf

1、氨基糖苷類抗生素是一類應(yīng)用廣泛的廣譜抗菌藥物，主要包括鏈霉素(SM)、慶大霉素(GM)、卡那霉素(KM)等，對奶牛乳房炎、子宮內(nèi)膜炎等有很好的療效，常用作獸醫(yī)臨床治療及飼料藥物添加劑。然而不規(guī)范用藥會引起畜禽產(chǎn)品尤其是泌乳動物乳汁中的藥物殘留，對人類的健康構(gòu)成潛在危害。 國內(nèi)外已經(jīng)建立了多種檢測牛奶中鏈霉素賤留的理化檢測方法，雖然有些方法比較靈敏、精確，但由于方法復(fù)雜、耗時長、花費大、技術(shù)要求高等原因而不適合大批量樣品的篩選。作

2、為一種靈敏、快速、特異性強的方法，酶聯(lián)免疫吸附測定法正逐漸應(yīng)用于藥物的殘留檢測。 為探索一種能夠快速有效的檢測牛奶中鏈霉素殘留的方法，本研究采用單克隆抗體技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附測定等技術(shù)，合成人工抗原，制備出抗鏈霉素單克隆抗體，建立了檢測牛奶中SM殘留的ELISA測定法，組建成鏈霉素快速檢測試劑盒并進行了優(yōu)化和實際應(yīng)用。 分別采用CMO法、活化酯法、戊二醛法合成了鏈霉素的5種人工抗原，從免疫原性及穩(wěn)定性等方面對5種抗原進行比

3、較，最終選擇活化酯法合成的BSA-SM/b作為免疫抗原，通過雜交瘤技術(shù)獲得1株能穩(wěn)定分泌抗鏈霉素特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株5C10。制備的腹水效價為1∶1280000，蛋白濃度為26.2mg/ml，與其他抗菌藥物的交叉反應(yīng)率均低于0.1％。 利用5C10雜交瘤細胞株的小鼠腹水單抗建立了檢測SM殘留的間接競爭ELISA方法。采用包被抗原稀釋度1∶3200，腹水抗體的工作濃度1∶1.6×105，標(biāo)準曲線線性方程為y=1.0522

4、-0.3276x(10～1000ng/ml)，半數(shù)抑制濃度為93.22ng/ml，檢測限約為5ng/ml。標(biāo)準曲線的批內(nèi)變異系數(shù)為11.87％，平均批間變異系數(shù)為8.017％。 初步組裝試劑盒并對試劑盒的各組分的穩(wěn)定性進行了檢測和優(yōu)化，成功建立了能在6個月內(nèi)維持穩(wěn)定的試劑盒，并以所組建的試劑盒對牛奶樣品中的添加藥物進行了測定。通過實驗比較了5種樣品處理方法，選擇用Careez法處理并4倍稀釋后用于測定。建立ELISA標(biāo)準曲線的線