赭曲霉毒素A直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒的研制.pdf

1、赭曲霉毒素是由真菌如曲霉菌(Aspergillu)和青霉菌(Penicillium)分泌的有毒代謝物。真菌在農(nóng)產(chǎn)品中大量滋生，它的代謝物存在于各種農(nóng)業(yè)原材料和商品中。真菌毒素具有400多種不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)是其主要的組成部分。OTA具有腎毒性、免疫毒性和致畸作用，被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)歸類(lèi)為致癌物質(zhì)?，F(xiàn)如今，最常用的檢測(cè)方法為儀器分析法和免疫分析法。儀器分析法包括質(zhì)譜法和高效液相

2、色譜法。該方法往往需要昂貴的儀器、操作繁瑣且需要專業(yè)的技術(shù)人員。免疫分析法包括酶聯(lián)免疫分析、放射免疫分析和膠體金免疫分析等。該方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，可以快速檢測(cè)大量的待測(cè)樣品。本實(shí)驗(yàn)制備了OTA單克隆抗體，研制出直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒，從而建立了快速、靈敏的OTA的檢測(cè)方法。
　　本研究將OTA和牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)偶聯(lián)合成免疫原OTA-BSA，把OTA和雞卵清蛋

3、白(Ovalbumin，OVA)偶聯(lián)合成檢測(cè)原OTA-OVA。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和紫外掃描的方法，鑒定合成的抗原，結(jié)果顯示合成成功。OTA-BSA和OTA-OVA偶聯(lián)比分別為7.5∶1與5∶1。免疫結(jié)果表明OTA-BSA免疫的小鼠，產(chǎn)生了免疫應(yīng)答。用OTA-OVA包板進(jìn)行檢測(cè)，其中1號(hào)小鼠免疫效果最好，其多抗血清效價(jià)最高可達(dá)1∶51200，半數(shù)抑制濃度IC50為7.98ng/mL。
　　選取免疫效價(jià)為1∶5

4、1200小鼠，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)進(jìn)行融合。取雜交瘤細(xì)胞上清液，采用間接ELISA法測(cè)其效價(jià)，用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)其抑制，從而篩選陽(yáng)性克隆。通過(guò)3輪亞克隆，共得到6株陽(yáng)性克隆細(xì)胞株，分別命名為1F5、2C5、2D7、2G3、3D7和3F6。選擇陽(yáng)性值最高的2G3制備腹水，之后對(duì)腹水進(jìn)行純化。采用SDS-PAGE鑒定，純化后單克隆抗體只含有2條清晰的條帶，分子量分別為50kDa和25kDa，說(shuō)明得到的單克隆抗體純度高。

5、通過(guò)ELISA鑒定，2G3純化前后的效價(jià)都達(dá)到1∶8.192×107，IC50為1.24ng/mL，親和力常數(shù)為2.11×1011mol/L。用亞型鑒定試劑盒檢測(cè)2G3，其亞型為IgG1、κ輕鏈型。該細(xì)胞株特異性高，敏感性好，可以用來(lái)研制試劑盒。
　　采用過(guò)碘酸鈉法，將2G3連接到HRP上，制備得到酶標(biāo)抗體。根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理，應(yīng)用酶標(biāo)抗體，研制出直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒，從而快速檢測(cè)OTA殘留。經(jīng)條件優(yōu)化后，OTA濃度與

6、結(jié)合率呈良好的線性關(guān)系(y=-31.186x+60.756，R2=0.9718)，IC50為2.21ng/mL，加標(biāo)樣品回收率范圍為80.3％～108％。該試劑盒與赭曲霉毒素B、C的交叉反應(yīng)率分別為3.6％和0.29％，與其他生物毒素均無(wú)交叉反應(yīng)。板間和板內(nèi)平均變異系數(shù)分別為6.41％和7.07％。玉米、小麥和花生樣品OTA的檢測(cè)限分別為0.134、0.203和0.292ng/mL。本研究制備的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA(cd-ELISA)試劑