赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素B-,1-的超微量免疫分析.pdf

1、采用時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)技術，建立赭曲霉毒素A(OTA)和黃曲霉毒素B1(AFB1)的高靈敏的TRFIA的檢測方法，并研制具有我國自主知識產權的快速、靈敏的OTA-TRFIA、AFB1-TRFIA檢測試劑盒，提高我國在毒素超微量免疫檢測的水平，解決我國農產品安全檢測方面的一些迫切要求，應對國際上技術壁壘的挑戰(zhàn)。 方法 1.OTA的TRFIA研究：首先采用碳二亞胺法，制備人工抗原OTA-KLH。以OTA-KL

2、H免疫大白兔制備多克隆抗體。以OTA-BSA免疫BALB/c鼠，制備抗OTA單克隆抗體。選擇包被濃度、標記條件、反應步驟、反應方式，配制增強液、洗液，編制全自動操作軟件；以稀土離子Eu3+標記的羊抗兔抗體進行示蹤，建立多克隆抗體間接競爭OTA-TRFIA。以稀土離子Eu3+標記的羊抗鼠抗體進行示蹤，建立單克隆抗體間接競爭OTA-TRFIA。組建OTA-TRFIA檢測試劑盒。按照標記免疫試劑要求，分別對OTA-TRFIA試劑盒進行靈敏度、

3、精密度、準確度、回收率、特異性、穩(wěn)定性考核，應用OTA-TRFIA試劑盒檢測國際質控，并與進口的OTA-ELISA試劑盒進行對照。 2.AFB1的TRFIA研究：將AFB1-BSA免疫新西蘭大白兔得到抗AFB1多克隆抗體。用黃曲霉毒素B1與辣根過氧化酶的聯結物(AFB1-HRP)包被96孔板為固相抗原，以稀土離子Eu3+標記的羊抗兔抗體進行示蹤，采用間接競爭免疫分析方法建立AFB1-TRFIA。組建AFB1-TRFIA檢測試劑盒

4、，對其進行考核，并與ELISA試劑盒進行對照。 結果 1.制備了可以用于免疫和篩選的OTA-KLH人工抗原，得到了抗OTA多克隆抗體和單克隆抗體。采用DTTA法，制備了Eu3+-羊抗兔抗體和Eu3+-羊抗鼠抗體。配制了所有的相關試劑，編制了全自動的分析軟件，組建了OTA-TRFIA、AFB1-TRFIA檢測試劑盒。 2.應用多克隆抗體建立的OTA-TRFIA方法的靈敏度為0.02μg/L，測量范圍為0.02μg/

5、L-400μg/L，批內和批間變異分別為2.6％和5.2％，平均回收率為95.8％。OTA-TRFIA的效應點值ED80、ED50、ED20分別為0.195g/L，1.018g/L和5.314g/L。 3.應用單克隆抗體建立的OTA-TRFIA方法的靈敏度為0.03μg/L，測量范圍為0.03μg/L-1000μg/L，批內和批間變異分別為3.7％和5.3％，平均回收率為94.2％。間接競爭OTA-TRFIA的效應點均值ED80

6、、ED50、ED20分別為0.33±0.02μg/L、1.44±0.08μg/L和5.22±0.12μg/L，樣品經TRFIA和進口的ELISA試劑盒同時檢測OTA，兩者的相關系數為0.925，結果相符。 4.OTA-TRFIA試劑盒測定英國環(huán)境食品和農產品部中心科學實驗室提供的OTA質控，結果為理論靶值的0.94-1.14，符合0.56-1.44之間的要求，說明OTA-TRFIA可以用于谷物中OTA的檢測。 5.應用多

7、克隆抗體建立的AFB1-TRFIA方法的靈敏度達到0.0039μg/L，AFB1-TRFIA的效應點均值ED80、ED50、ED20分別為0.034±0.004μg/L、0.160±0.011μg/L、1.048±0.170μg/L，方法的批內、批間變異系數平均為4.9％和8.9％。平均回收率為97.2％，AFB1-TRFIA和AFB1-ELISA試劑盒同時檢測樣品，兩者的相關系數為0.917，說明結果相符。 6.采用加速實驗的

8、方法考核OTA-TRFIA、AFB1-TRFIA試劑盒，其有效期可在一年以上，而且可以耐受夏天高溫的郵寄。 結論 1.研究表明，國內外首先報導的OTA-TRFIA是目前OTA檢測中最靈敏的方法之一，該分析方法穩(wěn)定性好、可測范圍寬、大大好于OTA-ELISA商品化試劑盒。測定英國環(huán)境食品和農產品部中心科學實驗室提供的OTA質控，結果高度符合，可以用于谷物中OTA的實際檢測，具有很好的應用前景。 2.AFB1-TRF