抗黃曲霉毒素B-,1-單鏈抗體的篩選和鑒定.pdf

1、黃曲霉毒素B1(Aflatxoni B1，AFB1)是黃曲霉毒素中毒性最強的一種毒素，它的危害性主要表現(xiàn)為強烈的毒性和致癌性，由于它在花生、玉米等食品中廣泛存在，因此嚴重危害了人們的身體健康。在現(xiàn)代社會里，隨著人們生活水平的提高，人們?nèi)找骊P(guān)注食品安全問題。目前食品安全已引起各國政府的密切關(guān)注，歐盟在2000年就提出了世界上安全標準和檢驗標準，其中AFB1為2μg/kg，總黃曲霉毒素為4μg/kg。
　　 用AFB1-BSA固相化

2、抗原包被酶標板，從Tomlinson單鏈抗體庫中篩選抗AFB1抗體。實驗中分別采用甘氨酸洗脫、胰蛋白酶洗脫和游離AFB1競爭洗脫三種不同的洗脫方法對吸附在酶標板上的噬菌體抗體進行特異性洗脫。經(jīng)過三輪篩選后，隨機挑取46個克隆，ELISA檢測發(fā)現(xiàn)用AFB1競爭洗處理得到的抗體庫中46個克隆中有28個陽性克隆，將此28個陽性克隆轉(zhuǎn)化到HB2151可溶性表達，ELISA檢測培養(yǎng)基上清全為陰性，反復(fù)凍融破碎菌體，取沉淀上清ELISA檢測發(fā)現(xiàn)5個

3、陽性克隆的沉淀上清呈陽性。采用親和層析的方法對細胞破碎液進行純化，通過SDS-PAGE電泳分析，在電泳圖上獲得一條純化后的單一條帶。競爭性ELISA檢測后得到2個能與游離AFB1特異性結(jié)合的陽性克隆，抑制率達到50%以上。酶切、PCR和DNA測序鑒定?；蛐蛄袦y定表明scFv屬于人類免疫球蛋白可變區(qū)。
　　 為了提高可溶性蛋白的表達量，研究了誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度和葡萄糖濃度對蛋白表達量的影響，通過對溫度、IPTG濃度和葡萄糖濃