黃曲霉毒素B1降解菌的分離鑒定及其降解特性.pdf

1、黃曲霉毒素是黃曲霉等真菌產(chǎn)生的具有強毒、致癌的次級代謝產(chǎn)物,常常造成農(nóng)產(chǎn)品和食品的嚴重污染。黃曲霉毒素污染不僅對人類和動物的健康造成極大的危害,而且?guī)砭薮蟮慕?jīng)濟損失,是食品安全中一個廣為關(guān)注的問題。在防控真菌毒素中,生物降解,尤其微生物的作用一直受到重視,人們希望借此開發(fā)一種安全實用、對食品營養(yǎng)價值無明顯影響的去毒方法。本文以黃曲霉毒素B1(AFB1)降解菌的分離鑒定為目的,從降解活性菌株篩選,降解作用與吸附結(jié)合作用的區(qū)分,pH干擾的

2、排除,活性菌株的鑒定,以及活性菌的降解特性等方面進行了研究,主要結(jié)果如下:
　　 1.以AFB1結(jié)構(gòu)類似物香豆素為唯一碳源,進行了AFBl降解菌的篩選。能利用香豆素的菌株進而與AFB1標準品(2.5μg/mL)作用,以AFB1去除率為指標進行復篩,從而得到可以去除毒素的菌株。利用這一方法,從不同生境的樣品中初篩到10株可在以香豆素為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長良好的細菌,復篩發(fā)現(xiàn)這些菌均具有良好的降解毒素的活性,其中從金毛羚牛糞便中篩

3、選出的菌株F4降解活性最好。F4菌的培養(yǎng)液在37℃與AFB1作用72h,毒素去除達到90.03％。同時建立了HPLC測定培養(yǎng)液中AFB1的方法。采用二氯甲烷提取,反相C18柱為分離柱,在362nm下進行檢測。結(jié)果培養(yǎng)液中的AFB1得到很好的分離,AFB1在0.01μg/mL～20.00μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,回歸方程為y=67.3368x-8.5095(R2=0.9997),AFBl的平均回收率為99.17%,RSD為2.39%。

4、結(jié)果表明,所建方法簡便準確可靠,能用于培養(yǎng)液中AFB1的定量檢測。
　　 2.在AFB1降解菌篩選中,pH的干擾以及吸附結(jié)合作用產(chǎn)生的假陽性常常影響結(jié)果的準確。研究采用了可靠的檢測方法,對降解與吸附結(jié)合作用進行了區(qū)分。由于菌株培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基pH會升高,高pH可引起毒素的破壞而影響判定結(jié)果,因而通過添加0.1%的KH2PO4、調(diào)低初始pH為6.5對培養(yǎng)基進行改良,結(jié)果表明,菌株在改良培養(yǎng)基中培養(yǎng)時,pH升高的情況得到了有效控制,

5、從而排除了pH的干擾;通過比較細胞滅活對AFB1去除的影響,分析菌株細胞水洗脫、有機溶劑萃取后AFB1的變化等方法,發(fā)現(xiàn)熱處理可導致細胞喪失去毒活性,對反應后的活細胞,經(jīng)反復水洗或者二氯甲烷萃取,都幾乎檢測不到AFB1,從而有效地排除了生物吸附結(jié)合的干擾,區(qū)分了降解作用和可逆的吸附作用,確定分離菌株F4和F7具有高效降解AFBl活性。
　　 3.根據(jù)形態(tài)染色、生理生化特性,以及16SrRNA序列同源性分析,對降解活性最好的菌株F

6、4進行了鑒定。通過PCR特異性擴增和測序獲得菌株F4的16SrRNA序列(1498bp),然后進行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明,F4與施氏假單胞菌的16SrRNA(AccessionNo.JN712254)同源性達到99%,結(jié)合形態(tài)染色、生理生化特征,初步鑒定為施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)。
　　 4.對F4菌株的降解特性和影響條件進行了研究。首先考察了細胞濃度、pH、溫度、金屬離子等對F4降解活性的影響。結(jié)

7、果表明,F4降解毒素活性物質(zhì)主要存在于菌細胞,在72h時,F4對AFB1的降解率達到最高,F4的降解活性與細胞濃度呈正相關(guān),pH和溫度對其降解水平有著顯著的影響,Mg2+對AFB1降解有增強作用,降解率增加7.68%,Cu2+抑制降解活性,降解率下降51.1%,提示活性物質(zhì)可能是一種胞內(nèi)酶;同時通過單因素試驗分析了F4降解毒素的影響條件,結(jié)果表明,當降解溫度為35℃,pH為7.0,Mg2+濃度為1.00mM時,F4細胞對AFBl的降解率