施氏假單胞菌F4降解黃曲霉毒素B1相關(guān)酶的分離、純化及其特性研究.pdf

1、黃曲霉毒素是一類主要由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有強(qiáng)毒性和致病性。在食品和飼料中，黃曲霉毒素污染現(xiàn)象非常普遍，這不僅對(duì)食品業(yè)和農(nóng)牧業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，而且對(duì)人類及動(dòng)物的健康帶來(lái)巨大的威脅，因此受到了廣泛的重視。在前期工作中，我們分離到了能高效降解黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)的菌株——施氏假單胞菌F4(Pseudomonas stutzeriF4)，在此基礎(chǔ)上，本論文針對(duì)F4產(chǎn)生的AFB1降解酶

2、(AFB1-degrading Enzyme，ADE)進(jìn)行了研究。通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件，提高產(chǎn)酶水平，對(duì)ADE分離純化方法，及其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。主要結(jié)果如下:
　　 1.以Pseudomonas stutzeri F4的產(chǎn)酶條件進(jìn)行考察和優(yōu)化。選擇與產(chǎn)酶相關(guān)的種齡、接種量、起始pH值、發(fā)酵時(shí)間以及溫度等5個(gè)因素，以ADE酶活為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)三因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面分析法優(yōu)化施氏假單胞菌發(fā)酵

3、產(chǎn)ADE的條件。結(jié)果表明，在接種量和起始pH值分別為3％和6.5時(shí)，最優(yōu)發(fā)酵條件理論值為種齡10.5h、發(fā)酵時(shí)間42.5h、溫度30.3℃，在此培養(yǎng)條件下，發(fā)酵液的ADE酶活可達(dá)到2769U，比優(yōu)化前提高了29％。
　　 2.降解AFB1酶的分離純化。用55％的硫酸銨沉淀處理，得到粗酶液，用DEAE-Sepharose Fast Flow層析柱進(jìn)行純化后，出現(xiàn)三個(gè)洗脫峰，于第三個(gè)峰(±132～152min)檢測(cè)出酶活，且在±14

4、4 min時(shí)相對(duì)酶活最大，為55％。然后通過(guò)Superdex G-100層析柱進(jìn)一步純化，結(jié)果出現(xiàn)兩個(gè)洗脫峰，于第二個(gè)峰(±920～1200min)檢測(cè)出酶活，且在±980 min時(shí)相對(duì)酶活最大，為45％。110mg的ADE原酶液通過(guò)55％硫酸銨沉淀、離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析分離純化后，ADE純化了123倍，總蛋白量為0.5mg，酶活為32×103U，比酶活為64×103 U/mg，表明其純化效果良好。
　　 3.基于純化的酶