抗黃曲霉毒素B1單鏈抗體基因的改造、表達(dá)純化和性質(zhì)研究.pdf

1、黃曲霉毒素B1(AflatxoniBl，AFB1)是毒性最強(qiáng)的真菌毒素之一，它具有致畸致癌致突變的三致作用，由于它在花生、玉米等食品中廣泛存在，因此嚴(yán)重危害了人們的健康。
　　 AFB1是一種半抗原，酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)是檢驗(yàn)半抗原的一種快速、簡(jiǎn)便的分析方法，而該檢測(cè)方法很大程度上依賴于高質(zhì)量的抗體。與傳統(tǒng)免疫動(dòng)物法獲得的抗體相比，重組抗體技術(shù)由于采用微生物表達(dá)的方法，獲得抗體的周期短，成本低，逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)。<

2、br>　　 本實(shí)驗(yàn)在已經(jīng)從Tomlinson I+J單鏈抗體文庫(kù)中篩選出抗AFB1單鏈抗體基因H4的基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行表達(dá)，以期獲得大量與AFBl結(jié)合的單鏈抗體。通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)H4的前1/5處有一琥珀抑制子TAG，說(shuō)明即TAG沒(méi)有起到終止作用而是由于密碼子的零星改變而被翻譯為谷氨酸。為了保證基因不被提前終止，實(shí)驗(yàn)中將TAG突變?yōu)榫幋a谷氨酸的GAA，之后通過(guò)克隆載體、表達(dá)載體的構(gòu)建，再將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主大腸桿菌BL21(DE3)和乳酸克魯

3、維酵母GG799，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和生物活性的鑒定實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，突變后的H4即H4-Glu能在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達(dá)，表達(dá)量為25.5 mg/L，其與AFB1的結(jié)合活性明顯；H4-Glu在乳酸克魯維酵母中實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá)，與AFB1有一定的結(jié)合活性，但由于獲得的是單拷貝整合轉(zhuǎn)化子，表達(dá)量不高。
　　 對(duì)于獲得的抗體，測(cè)定了游離AFB1對(duì)其的半數(shù)抑制率IC50及抗體與AFB2，AFG1，AFG2的交叉反應(yīng)性。AFB1對(duì)抗

4、體的IC50為3.77 ng/mL，抗體與AFB2、AFG1、AFG2均有交叉反應(yīng)，從強(qiáng)到弱依次為AFG1、AFB2、AFG2。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)純化的抗體在4℃可至少存放3個(gè)月；冷凍干燥對(duì)抗體的活性有影響，可使其活性損失約50％；抗體可以耐受40℃高溫，保溫4h后活性仍可殘留40％，但不能耐受50℃高溫；中偏堿性條件下有利于抗體的活性保存。
　　 本實(shí)驗(yàn)成功將抗AFB1單鏈抗體基因H4中的TAG突變?yōu)镚AA；分別將其在原核表達(dá)系統(tǒng)中的大