黃曲霉毒素B1免疫親和柱的制備及初步應(yīng)用.pdf

1、黃曲霉毒素屬于真菌毒素，是由曲霉屬中的寄生曲霉和黃曲霉產(chǎn)生的一類結(jié)構(gòu)相似的次級(jí)代謝產(chǎn)物，糧食和食品中的主要存在形式是黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1及M2，其中黃曲霉毒素B1(AFB1)的毒性和致癌性最強(qiáng)，可以引起人類的慢性中毒，損害機(jī)體的多個(gè)臟器，生殖紊亂和免疫抑制等，特別是肝臟損害以及肝癌。很多國家都為本國的食品、飼料等制定了AFB1的限量標(biāo)準(zhǔn)。因此，簡便高效的樣品凈化前處理方法和靈敏特異的檢測技術(shù)對(duì)維護(hù)食品安全具有重要意義。

2、
　　免疫親和柱法作為一種樣品富集和凈化的前處理方法，因其高特異性、高靈敏度及凈化效果好等優(yōu)勢(shì)，逐步用于真菌毒素凈化和富集。與儀器分析法相比，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)具有特異性高、重復(fù)性較好、操作簡單、成本較低等優(yōu)點(diǎn)。將ELISA與免疫親和柱純化和富集方法相結(jié)合，可以提高檢測靈敏度。本研究的目的是:(1)建立AFB1的免疫親和層析柱;(2)優(yōu)化該親和層析柱的使用條件;(3)與ELISA方法相結(jié)合的檢測飼料樣品中AFB1的適用性

3、。
　　研究結(jié)果表明:(1)用高純度的AFB1單克隆抗體和溴化氰活化的Sepharose4B進(jìn)行偶聯(lián)、裝柱，偶聯(lián)率為98％，柱容量為646ng。(2)免疫親和柱可以多次使用，但是免疫親和柱的富集效果會(huì)有所下降:7次重復(fù)使用后可從85％下降到73％。故優(yōu)化柱子的再生方法，分別用高pH與低pH的緩沖液交替洗滌，經(jīng)過再生后的柱子對(duì)AFB1的富集率可高達(dá)93.7％。(4)食品或飼料樣品需用pH中性、低濃度有機(jī)溶劑或鹽溶液進(jìn)行萃取，強(qiáng)有機(jī)溶

4、劑或強(qiáng)酸或強(qiáng)堿會(huì)影響抗體活性，進(jìn)而降低富集效率和親和柱的使用次數(shù)。(5) AFB1單克隆抗體免疫親和柱的富集條件:上樣緩沖液流速為3ml/min，緩沖液中甲醇濃度為40％;洗脫液含30％甲醇-1M NaCl(pH=2.1)，150ng標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)8ml洗脫液體積。經(jīng)加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)計(jì)算得到平均回收率為88.1％，變異系數(shù)0.62～2.37％。(6)免疫親和柱在4℃放置70天的樣品回收效率為80％。(7)用HPLC方法和免疫親和-ELISA聯(lián)