等離子共振傳感器定量檢測黃曲霉毒素B1的研究和玉米赤霉烯酮免疫親和柱的評價.pdf

1、真菌毒素是真菌生長過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于食品及飼料中，嚴(yán)重危害人和動物的健康。因此，建立快速靈敏的真菌毒素檢測方法對于食品和飼料的安全監(jiān)管具有重要的意義。免疫學(xué)檢測方法基于抗原抗體的特異性結(jié)合，靈敏度高且簡單易操作。本研究建立了適于真菌毒素的免疫學(xué)快速檢測方法。由于ELISA方法具有檢測時間短、前處理簡單、低成本、高靈敏度等優(yōu)點，具有廣泛的應(yīng)用前景，本課題建立了適用于黃曲霉毒素B1（AFB1）的高靈敏ELISA檢測方法；由

2、于等離子共振傳感器有免標(biāo)記，實時監(jiān)測，高靈敏等優(yōu)點，建立了適于黃曲霉毒素B1定量檢測的等離子共振傳感器方法；此外，為了獲得理想的檢測結(jié)果，制備了玉米赤霉烯酮免疫親和柱，該免疫親和柱可作為有效的樣品前處理凈化手段，結(jié)合其他檢測方法可實現(xiàn)玉米赤霉烯酮高靈敏檢測。
　　1、通過基質(zhì)輔助激光解離飛行時間質(zhì)譜對合成偶聯(lián)產(chǎn)物AFB1-BSA進行鑒定，監(jiān)控其是否制備成功；該抗原用于ELISA檢測中，測得AFB1單抗的效價為1:8000，建立的間

3、接競爭ELISA實驗方法IC50值為0.224 ng/mL，該抗體對AFB1結(jié)構(gòu)類似物有較高的交叉反應(yīng)，適用于檢測黃曲霉毒素類物質(zhì)；應(yīng)用此抗體建立間接競爭ELISA方法，對加標(biāo)花生樣品進行測定，回收率為103.45-132.29％，變異系數(shù)為0.74-9.07%，與LC-MS/MS驗證試驗測定結(jié)果相一致。
　　2、優(yōu)化了金膜表面自組裝單層膜形成條件（裸金片浸泡溫度及時間）、抗原進樣流速、耦合緩沖液、抗原濃度、反應(yīng)緩沖液、抗體反應(yīng)濃

4、度和洗脫條件等參數(shù)，確定了等離子共振傳感器定量檢測黃曲霉毒素B1的最佳條件：金片浸泡于4℃、1 mM的巰基十一烷酸乙醇溶液中12 h，抗原進樣流速為20μL/min，耦合緩沖液為離子濃度10 mM，pH4.5的醋酸鈉緩沖液，抗原濃度為30μg/mL，固定時間為12.5 min；反應(yīng)緩沖液為HBS緩沖液，抗體濃度為15μg/mL，反應(yīng)時間為15 min，流速為20μL/min。該方法對AFB1的最低檢測限為0.312 ng/mL，線性范圍

5、是0.625-10 ng/mL。與AFB2、AFG1、AFG2和AFM1的交叉反應(yīng)率分別為72%、33%、43%和48%，表明此方法除了可檢測AFB1外，還可用于黃曲霉毒素總量的檢測。
　　3、對制備的玉米赤霉烯酮免疫親和柱的性能進行評價。該免疫親和柱對ZEN的平均柱容量為580 ng/0.3 mL凝膠；柱空白為0；1 mL甲醇可以將添加標(biāo)準(zhǔn)品洗脫95%以上；連續(xù)使用5次后柱容量將下降到初始柱容量的50%。該免疫親和柱對其它五種玉