建立IAC-HPLC檢測谷物中的玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A.pdf

1、玉米赤霉烯酮(Zearelenone，ZEN)主要是由玉米赤霉菌(Gibberella zeae)、禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)和三線鐮刀菌(Fusarium tricinctum)等真菌所產(chǎn)生的具有雌激素毒性作用的真菌毒素。 赭曲霉毒素(Ochratoxins)產(chǎn)生菌主要是赭曲霉(Asperillus ochraceus)和純綠青霉(Penicillium verrucosum)，具有腎臟毒性、免疫

2、抑制毒性、神經(jīng)毒性、致畸性及致癌性，有A、B、C、D四種化合物。其中毒性最大、分布最廣、對農(nóng)作物的污染最嚴(yán)重、與人類健康關(guān)系最密切的是赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)。1993年國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(The International Agency for Research onCancer，IARC)已將OTA列為可能的人類致癌物。 本研究分別建立了IAC-HPLC(Immunoaffinity column-H

3、igh PerformanceLiquid Chromatography,IAC-HPLC)方法檢測谷物中的ZEN和OTA；并用此方法檢測了49份市售谷物中的ZEN含量及20份市售谷物中的OTA含量?，F(xiàn)將研究結(jié)果分述如下： 1．建立IAC-HPLC方法檢測谷物中的ZEN 1．1抗ZEN單克隆抗體免疫親和柱的研制將制備好的抗ZEN單克隆抗體與溴化氰(CNBr) 活化的瓊脂糖凝膠(Sepharose)4FF偶聯(lián)。采用紫外掃

4、描鑒定偶聯(lián)反應(yīng)，間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assays，ELISA)方法及HPLC方法評價(jià)制備好的免疫親合柱。每根抗ZEN單克隆抗體免疫親和柱，使用0.5mL活化膠，0.35 mg抗ZEN單克隆抗體，柱容量為0.40μg。 1．2建立IAC-HPLC分析谷物中ZEN含量該方法線性范圍10 μg/kg～700 μg/kg，信噪比為3:1時(shí)，最低檢測限為10 μg/kg；小麥和

5、玉米樣品添加ZEN標(biāo)準(zhǔn)品(60 μg/kg～300 μg/kg)，用80％甲醇水溶液提取樣品中ZEN，經(jīng)免疫親和柱凈化、0.01 mol/L的PBS淋洗、純甲醇洗脫，HPLC熒光法檢測，平均回收率分別為76.33％～90.10％和78.36％～ 99.64％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為6.68％～10.93％和7.28％～10.33％。 1.3市售谷物中ZEN含量的測定對49份谷物使用本實(shí)驗(yàn)建立的IAC-HPLC方法進(jìn)行了檢

6、測，同時(shí)使用商品化ELISA試劑盒進(jìn)行了對照。二者的結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著性差異(P>0.05)。 2．建立IAC-HPLC方法檢測谷物中的OTA 2.1抗OTA單克隆抗體免疫親和柱的制備將制備好的抗OTA單克隆抗體與CNBr活化的Scpharose 4FF偶聯(lián)。采用紫外掃描鑒定偶聯(lián)反應(yīng)，間接競爭ELISA方法及HPLC方法評價(jià)制備好的免疫親合柱。每根抗OTA單克隆抗體免疫親和柱，使用0.5 mL活化膠，0.10 mg

7、抗OTA單克隆抗體，柱容量為0.15 μg。 2．2建立IAC-HPLC分析谷物中OTA含量該方法線性范圍0.2 μg/kg～300 μg/kg,信噪比為3:1時(shí)，最低檢測限為0.2μg/kg；小麥和玉米樣品添加OTA標(biāo)準(zhǔn)品(5 μg/kg～100 μg/kg)，用70％甲醇水溶液提取樣品中OTA，經(jīng)免疫親和柱凈化、0.01 mol/L的PBS淋洗、純甲醇洗脫，HPLC熒光法檢測，平均回收率分別為90.72％～102.87％和