體內(nèi)真菌毒素生物標(biāo)記物赭曲霉毒素A檢測(cè)方法的研究.pdf

1、赭曲霉毒素A(OchratoxinA，OTA)主要是由曲霉屬和青霉屬真菌赭曲霉產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，具有腎毒性、致癌性和免疫抑制作用，對(duì)人類和動(dòng)物的生命健康構(gòu)成極大威脅。1993年，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將OTA列為人類可能的致癌物(2B級(jí));2007年，美國國家毒理學(xué)計(jì)劃將OTA定為極有可能對(duì)人類產(chǎn)生致癌性的物質(zhì)。OTA廣泛污染農(nóng)作物、食品和飼料，在谷物、啤酒、紅酒、葡萄汁、咖啡、人參、草藥、調(diào)味料和干果等中均能檢測(cè)到OTA。為此，歐盟委員會(huì)

2、對(duì)許多食物、飲料中OTA的含量做了明確限定，世界衛(wèi)生組織食品添加聯(lián)合專家委員會(huì)和歐洲食品安全局規(guī)定人體對(duì)OTA每周最大耐受量分別為100和120ng·kg-1·b.w.。OTA主要通過尿液排出體外，但是，由于OTA在尿液中痕量存在，而且尿液基質(zhì)比較復(fù)雜，準(zhǔn)確檢測(cè)尿液中OTA面臨巨大挑戰(zhàn)。因此，為了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)人和動(dòng)物暴露于OTA的污染水平，有必要建立靈敏、快速、可靠的檢測(cè)人和動(dòng)物尿液、血液中真菌毒素生物標(biāo)記物OTA的方法。
　　由于O

3、TA在血液和尿液中的主要代謝物為其原型，本論文重點(diǎn)建立檢測(cè)人和動(dòng)物尿液、血液中OTA的HPLC-FLD、UHPLC-FLR和LC-MS/MS方法。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1、建立了快速檢測(cè)大鼠尿液和血液中赭曲霉毒素 A的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)方法。
　　大鼠灌胃給予含OTA的黃芪提取液，于不同時(shí)間點(diǎn)眼眶取血。
　　取100μL大鼠血漿，加入500μL丙酮，渦旋1 min后以15000 rpm離心5

4、min，上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，于45℃下氮?dú)獯蹈?，向殘?jiān)屑尤? mL乙腈-水溶液(20∶80，V/V)使溶解，渦旋1 min后過0.22μm微孔濾膜，進(jìn)樣分析。
　　取100μL于室溫下解凍后以10000rpm離心5 min的大鼠尿液樣品，加入900μL乙腈-水溶液(20∶80，V/V)，渦旋1 min后過0.22μm微孔濾膜，進(jìn)樣分析。LC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果顯示，OTA在0.1～100 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)

5、系良好，R2為0.9999。在加標(biāo)水平分別為0.1、1和10 ng·mL-1時(shí)，血漿中OTA的平均加樣回收率為86.8％～90.5％，RSDs為2.0％～6.7％;在加標(biāo)水平分別為0.2、2和10 ng·mL-1時(shí)，尿液中OTA的平均加樣回收率為95.6％～100.9％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于5.0％。血漿和尿液中OTA的定量限分別為0.1和0.2 ng·mL-1。該研究結(jié)果表明，建立的LC-MS/MS方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、準(zhǔn)確性好，可用于

6、大鼠等動(dòng)物尿液和血液中OTA的定性定量測(cè)定。
　　2、建立了檢測(cè)人體尿液中赭曲霉毒素A的分子印跡聚合物固相萃取柱凈化-高效液相色譜-熒光檢測(cè)法(HPLC-FLD)。
　　隨機(jī)收集北京地區(qū)65名志愿者的晨尿，10000 rpm離心10 min，經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾后，取10 mL濾液于錐形瓶中，用0.1 MHCl溶液調(diào)pH至2.5，用預(yù)先經(jīng)過4 mL乙腈和4 mL水處理的赭曲霉毒素A分子印跡聚合物固相萃取柱凈化，7 mL0.1

7、M HCl-乙腈(60∶40，V/V)溶液淋洗，3 mL甲醇（含2％乙酸）洗脫，洗脫液于45℃C氮?dú)庀麓蹈桑糜?℃保存。HPLC-FLD檢測(cè)待測(cè)物中OTA的含量，液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS/MS）確證陽性樣品。結(jié)果顯示，赭曲霉毒素A在0.75～250 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測(cè)限和定量限分別為0.25ng·mL-1和0.75 ng·mL-1，OTA在2、10、20 ng·mL-13個(gè)加樣水平的回收率為90.6％～101.

8、9％，RSDs為0.1％～1.6％。實(shí)際測(cè)得5份尿液樣品為陽性，OTA最大含量為0.091 ng·mL-1。以上研究結(jié)果表明，建立的HPLC-FLD方法簡(jiǎn)單、快速、可靠，適用于人體尿液中OTA的檢測(cè)。
　　3、建立了檢測(cè)人體尿液中赭曲霉毒素A的分子印跡聚合物固相萃取柱凈化-超高效液相色譜-熒光檢測(cè)方法(UHPLC-FLR)。
　　取60份健康志愿者的晨尿樣品，10000 rpm離心10 min，玻璃纖維濾紙過濾，取10 mL

9、濾液于錐形瓶中，用0.1 M HCl溶液調(diào)pH至2.5，用赭曲霉毒素A分子印跡聚合物固相萃取柱凈化，經(jīng)過淋洗之后，用UHPLC-FLR法檢測(cè)洗脫下來的OTA的含量，并對(duì)影響分子印跡聚合物固相萃取柱凈化效率的主要參數(shù)進(jìn)行1了優(yōu)化。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，該方法的檢測(cè)限和定量限分別為0.2 ng·mL-1和0.6 ng·mL-1。OTA在0.6、6.0、60 ng·mL-13個(gè)加樣水平的回收率為92.0％～98.9％。實(shí)際樣品測(cè)定表明，4份尿液