赭曲霉毒素A無(wú)毒免疫學(xué)快速檢測(cè)方法的研究.pdf

1、赭曲霉毒素是真菌毒素的一種，由青霉屬（ Penicillium）和曲霉屬（Aspergillus）的某些菌株產(chǎn)生的二級(jí)代謝產(chǎn)物。它包含有七種結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，其中以赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）的毒性最大、分布最廣、產(chǎn)毒量最高、污染最嚴(yán)重。OTA具有強(qiáng)烈的免疫毒性、神經(jīng)毒性、腎毒性和肝毒性，并且還有致癌、致畸和致突變作用，且OTA很難在人體和動(dòng)物體內(nèi)代謝，半衰期長(zhǎng)，易在組織和血液中蓄積，因此OTA與人類(lèi)健康的關(guān)系最密切，所以

2、實(shí)現(xiàn)對(duì)OTA的快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)意義重大。免疫學(xué)分析法以敏感度更高，檢出限更低，檢測(cè)速度更快的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)在OTA定量、定性檢測(cè)中廣泛應(yīng)用。但是當(dāng)前的免疫學(xué)檢測(cè)方法都是采用標(biāo)記毒素純品或偶聯(lián)毒素到大分子蛋白作為競(jìng)爭(zhēng)抗原基礎(chǔ)上的含毒素檢測(cè)體系，存在毒素標(biāo)品昂貴、對(duì)檢驗(yàn)操作人員的健康危害很大等缺陷，限制了它的應(yīng)用和推廣。近年來(lái)，利用噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)展示技術(shù)得到的模擬表位肽替代毒素作為抗原，建立的無(wú)毒檢測(cè)體系推動(dòng)了OTA無(wú)毒免疫學(xué)快速檢測(cè)的發(fā)展

3、，解決了OTA毒性大、操作不方便等問(wèn)題。本研究利用篩選噬菌體隨機(jī)七肽庫(kù)得到OTA的模擬表位，并以含有模擬表位序列的噬菌體粒子替代赭曲霉毒素A建立OTA的無(wú)毒免疫學(xué)檢測(cè)方法。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴以純化后的抗赭曲霉毒素A單克隆抗體為靶分子，親和淘選融合表達(dá)在絲狀 M13噬菌體次要衣殼蛋白上的隨機(jī)七肽庫(kù)。經(jīng)過(guò)四輪的親和淘選，隨著洗滌液中吐溫-20含量的增加和靶分子濃度的逐漸降低，噬菌體的洗脫量從第一輪的7.3×105pfu/mL

4、增加到第四輪的7.8×109pfu/mL，回收率從第一輪的7.3×10-4％增加到7.8%，因此可以得到能夠跟靶分子結(jié)合的噬菌體粒子得到了有效的富集，為以后試驗(yàn)的順利開(kāi)展奠定了良好的基礎(chǔ)。⑵通過(guò)間接Phage-ELISA鑒定從第四輪淘選洗脫液測(cè)定滴度的板子上挑選的52株噬菌斑克隆，得到52株克隆都為陽(yáng)性噬菌體，陽(yáng)性率達(dá)到100%。再挑選其中的22株克隆進(jìn)行進(jìn)一步的間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA檢測(cè)，得到22株陽(yáng)性噬菌體克隆與抗 OTA單克隆抗體的

5、結(jié)合都能夠被 OTA標(biāo)品所阻斷，且敏感性較高，IC50均在8ng/mL以下，特異性試驗(yàn)結(jié)果也表明22株噬菌體只能夠與抗OTA單克隆抗體，與其他的無(wú)關(guān)單抗沒(méi)有結(jié)合。通過(guò)分析噬菌體載體插入的多肽序列分析，可以得到多肽的主要共有序列為MPLWXDL（X為任意氨基酸）。⑶在成功篩選得到帶有OTA的模擬表位序列的陽(yáng)性噬菌體的基礎(chǔ)上，采用間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA建立了 OTA檢測(cè)的 ELISA方法。經(jīng)過(guò)各種方法的優(yōu)化，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸很好，R2=0.9