用噬菌體展示技術(shù)建立赭曲霉毒素A無毒酶聯(lián)免疫吸附分析方法的研究.pdf

1、赭曲霉毒素A(OchratoxinA，OTA)是由曲霉屬和青霉屬的某些菌種產(chǎn)生的一種真菌毒素，具有腎毒性、肝毒性、致畸性和免疫毒性。及時(shí)進(jìn)行OTA檢測是預(yù)防其對人類和動(dòng)物造成危害的主要手段。酶聯(lián)免疫吸附分析方法(ELISA)由于具有操作簡單、快捷、不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備和可同時(shí)測定大批量樣品等優(yōu)點(diǎn)，對檢測OTA有極高的應(yīng)用價(jià)值。然而，常規(guī)ELISA方法檢測OTA必須涉及到標(biāo)準(zhǔn)品OTA和偶聯(lián)OTA的使用，不僅給試劑的生產(chǎn)和使用者帶來毒性危害

2、，而且還存在OTA的標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴和進(jìn)口受限制等問題。噬菌體展示文庫技術(shù)可用來篩選能模擬原始蛋白質(zhì)或小分子量物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的多肽分子，因此可利用這一技術(shù)獲得OTA的替代品來解決這一問題。 為了建立不使用OTA的無毒ELISA分析方法，本研究將OTA的羧基與載體蛋白的氨基共價(jià)連接，制備了OTA人工抗原并免疫BALB/C小鼠，再通過雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備了二種抗OTA的單克隆抗體。為了獲得能替代OTA使用的模擬表位肽，以一種單克隆抗體

3、作為靶分子，對融合表達(dá)在M13絲狀噬菌體衣殼蛋白Ⅲ上的隨機(jī)七肽庫進(jìn)行親和篩選，通過ELISA方法篩選和鑒別具有模擬表位的陽性噬菌體克隆，并用陽性克隆替代OTA建立了無毒ELISA分析方法；通過對陽性克隆進(jìn)行DNA測序確定模擬表位肽的氨基酸序列及共有序列，同時(shí)經(jīng)化學(xué)方法合成二種多肽對模擬表位肽進(jìn)行驗(yàn)證，并用Antheprot4.6軟件對模擬表位肽的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析探討其作用機(jī)理。經(jīng)過四輪篩選，共獲得了11株具有模擬表位肽的陽性噬菌體

4、克隆，模擬表位肽的共有序列是異亮氨酸-精氨酸(或纈氨酸)-脯氨酸-蛋氨酸-纈氨酸(或亮氨酸)-X-X，縮寫為IR(V)PMV(L)XX(X為任意氨基酸)。其中利用克隆P2建立的檢測方法最為靈敏，其線性范圍在200-8000pg/mL之間，檢測下限為150pg/mL，與赭曲霉毒素B的交叉反應(yīng)率為35％，與桔霉素、黃曲霉毒素B1和展青霉素等毒素交叉反應(yīng)低于0.01％。該方法經(jīng)常規(guī)ELISA和高效液相色譜(HPLC)分析方法驗(yàn)證，顯示了良好的