苯乙醇胺A和沙丁胺醇單克隆抗體的制備及其酶聯(lián)免疫吸附分析方法的建立.pdf

1、隨著社會的進步和生活水平的提高，人們對食品安全越來越重視，尤其關注食品中存在的對人體健康產(chǎn)生不利影響的獸藥殘留。作為七大獸藥殘留中的一大類，β-受體激動劑因其顯著的營養(yǎng)再分配作用，常被非法用在畜牧業(yè)生產(chǎn)中。肉制品中殘留的β-受體激動劑通過食物鏈可在人體內(nèi)累積，危害消費者的身體健康。由β-受體激動劑引發(fā)的各類中毒事件也是時有發(fā)生，造成了惡劣的社會影響。因此，急需建立方便快速的檢測方法加強對這類β-受體激動劑的監(jiān)管。本文希望通過制備高靈敏度

2、、高特異性的苯乙醇胺 A和沙丁胺醇單克隆抗體，建立相應的酶聯(lián)免疫吸附分析方法(ELISA)，用來有效的監(jiān)測實際樣品中的β-受體激動劑殘留。
　　苯乙醇胺A（Phenylethanolamine A，PA）是近年來出現(xiàn)的一種新的β-受體激動劑，目前作為促生長劑被非法用于畜牧業(yè)中。本研究成功制備了針對苯乙醇胺 A的特異性單克隆抗體，在此基礎上建立了高靈敏度、高特異性的用于檢測動物組織樣品中苯乙醇胺A的ELISA法。首先對苯乙醇胺A的分

3、子結構進行修飾，使之成為帶氨基的半抗原衍生物，再與載體蛋白即牛血清白蛋白（Bovine serum albumin, BSA）或卵清白蛋白（Ovalbumin, OVA）偶聯(lián)，形成免疫原以及包被原。其中以PA-BSA偶聯(lián)物為免疫原免疫小鼠，取免疫小鼠的脾細胞與小鼠的骨髄瘤細胞融合后獲得了一株靈敏度較高的單克隆抗體細胞株。以單克隆抗體為基礎建立了檢測苯乙醇胺 A的間接競爭 ELISA法，并對方法的靈敏度，特異性，精確度以及準確性進行了表征

4、。在最優(yōu)條件下，基于同源性包被抗原/抗體測定苯乙醇胺 A的ELISA法的IC50為0.16 ng/mL，檢出限（LOD）為0.011 ng/mL，比已有文獻的靈敏度高1.3-17倍。與其它十四種β-受體激動劑的交叉反應低于0.59％，證明所建立的ELISA不僅靈敏度高，而且特異性強。選擇豬肉以及豬肝作為實際樣品進行樣品加標回收實驗，回收率在91.40-105.51%，批內(nèi)變異系數(shù)(Coefficients of variation, C

5、V)為1.56–9.92%(n=3)，批間CV為2.02-11.71%(n=3)。用高效液相色譜串聯(lián)質譜（LC–MS/MS）對ELISA進行驗證，發(fā)現(xiàn)兩種方法結果的相關系數(shù)為0.98，相關性良好。本文所建立的ELISA法具有靈敏度高、特異性強、簡便、準確可靠的特點，可用于實際樣品中苯乙醇胺 A的檢測。
　　沙丁胺醇是繼克倫特羅之后另一種被普遍濫用的β-受體激動劑。本研究通過丁二酸酐法合成沙丁胺醇衍生物，使之帶有活性基團羧基，再與載