酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法

1、酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法 測(cè)定血清中甲胎蛋白含量,臨床八年1205班2組 陳旭 陳楷 李皓,,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?,,,,,1 掌握酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）的原理,2 熟悉酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的操作方法,,,二、實(shí)驗(yàn)原理,基礎(chǔ)知識(shí) 1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者Van Weerman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫

2、測(cè)定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。ELISA現(xiàn)在已成為目前分析化學(xué)領(lǐng)域中的前沿課題 ，它是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫酶技術(shù)( immunoenzymatic techniques ) 的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù)。,,,,甲胎蛋白（α fetoprotein，AFP） 一種含4%碳水化合物的單鏈糖蛋白，分子量70KD

3、，半衰期 5天，由592 個(gè)氨基酸殘基的單肽鏈組成?；蛭挥诘?對(duì)染色體4q1124q21區(qū)域，由 15 個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子組成，屬于血清中一種α球蛋白，是一種胚胎性相關(guān)蛋白。自1963年發(fā)現(xiàn)以來，作為一種腫瘤特異性抗原已廣泛應(yīng)用于臨床。它對(duì)原發(fā)性肝癌的早期診斷具有重要意義，同時(shí)對(duì)肝細(xì)胞癌的鑒別診斷，流行病學(xué)調(diào)查和理論研究都很有價(jià)值。,,,原理一 ELISA的基礎(chǔ)是抗原（或抗體）的固相化及抗原（或抗體）的酶標(biāo)記。結(jié)合在固

4、相載體表面的抗原（或抗體）仍保持其免疫學(xué)活性。原理二 抗原(或抗體)可通過共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性。原理三 固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。,,,ELISA的三條

5、基本原理,雙抗體夾心法,方法 用已知抗體包被，加入待測(cè)抗原，再加酶標(biāo)抗體，加底物顯色。 固相(包被)抗體Ab + 樣品(抗原Ag) + 酶標(biāo)抗體Ab * → Ab-Ag-Ab* + 底物(TMB)→顯色應(yīng)用 這種方法欲測(cè)的抗原必須有兩個(gè)可以與抗體結(jié)合的部位，因?yàn)槠湟欢艘c包被于固相載體上的抗體作用，而另一端則要與酶標(biāo)記特異性抗體作用。,,,雙抗體夾心法圖示,,,三、實(shí)驗(yàn)儀器&試劑,,,儀器 全自動(dòng)酶

6、標(biāo)儀、全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī),試劑 待測(cè)血清、抗-AFP-L3 抗體、封閉蛋白溶液、辣根過氧化物酶（HRP）、底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB)、顯色液、終止液……OR: 甲胎蛋白（AFP）定量測(cè)定試劑盒（酶聯(lián)免疫法）,,,四、實(shí)驗(yàn)步驟,,,獲得AFP未標(biāo)定抗體,將AFP抗體與固相載體連接形成固相抗體,,,洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì),,加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結(jié)合位點(diǎn),,洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白,,加血清形成固相抗

7、體－抗原復(fù)合物,,洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì),,加HRP酶標(biāo)抗體生成抗體—待測(cè)抗原—酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物,,徹底洗滌未結(jié)合 的HRP酶標(biāo)抗體,,加底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)進(jìn)行酶催化反應(yīng),根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行AFP的定量測(cè)定,,,,詳細(xì)步驟,,,1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10 孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μl，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100μ

8、l 分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl 棄掉，再各取50μl 分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六中各取50μl 分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μ，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取

9、50μl 棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為（1800ng/L ，1200ng/L，600ng/L，300ng/L， 150ng/L）。,2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品最終稀釋度為5 倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育

10、30 分鐘。4. 配液：將20 倍濃縮洗滌液用蒸餾水20 倍稀釋后備用5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此重復(fù)5 次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。7. 溫育：操作同3。8. 洗滌：操作同5。9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 分鐘.10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立

11、轉(zhuǎn)黃色）。11. 測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測(cè)量各孔的吸光度（OD 值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。,,,辣根過氧化物酶(HRP),,,常用底物：(1)鄰苯二胺(OPD)：反應(yīng)顯橙黃色，應(yīng)避光，致癌性。(2)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)：TMB是一種脂溶性較強(qiáng)的基團(tuán)，由于這種高度的脂溶性，使其易形成多聚體，在HRP活性部位產(chǎn)生粗大的、深藍(lán)色沉淀物反應(yīng)后呈藍(lán)色。酶反應(yīng)用HCL或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物

12、由藍(lán)色呈黃色，最適吸收波長為 450nm。,五、結(jié)果分析,以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。,,,六、思考題,試驗(yàn)中哪些因素可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響？,,,（一）固相載體（二）抗原 （三）試驗(yàn)樣品 （四）

13、結(jié)合物 (五）洗滌劑與稀釋劑（六）底物 （七）作用時(shí)間 (八)試驗(yàn)的重復(fù)性（精確度） （九）對(duì)使用儀器要求,六、應(yīng)用,,,檢查抗原半抗原1.內(nèi)分泌方面已經(jīng)用于檢測(cè)雌性激素、絨毛膜促性腺激素、黃體素、胰島素、皮質(zhì)醇、促甲狀腺素和孕酮等2.在血液學(xué)方面可用于檢查凝固因子（如第Ⅷ凝固因子）、紅細(xì)胞抗原及結(jié)合球蛋白（Hapto Globin）等 檢查抗體1.在寄生蟲病方面，它用于對(duì)瘧原蟲、阿米巴、利日曼原蟲、錐蟲、血吸蟲、