多氯聯(lián)苯的酶聯(lián)免疫吸附分析.pdf

1、多氯聯(lián)苯(Polychlorinated biphenyls，PCBs)是聯(lián)合國(guó)環(huán)境保護(hù)署要求逐步消除的持久性有機(jī)污染物之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)，在全世界生產(chǎn)的工業(yè)PCBs約有2×107噸，其中排放到環(huán)境中的約占31％。PCBs作為一種環(huán)境污染物在世界范圍內(nèi)廣泛分布，含量從ppt到幾百個(gè)ppm不等。目前分析PCBs在環(huán)境中的含量最常用的方法是色譜法，這種方法需要復(fù)雜的樣品前處理過(guò)程、精密的分離檢測(cè)儀器、良好的實(shí)驗(yàn)環(huán)境和訓(xùn)練有素

2、的操作人員，所以限制了其應(yīng)用。與色譜法相比，酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)樣品前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低，并能應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。因此，開(kāi)展PCBs的酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)方法的研究，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 多氯聯(lián)苯是聯(lián)苯上的氫原子在不同程度上被氯原子取代后生成的人工有機(jī)化合物的總稱，共有209種同系物。本研究選取共面PCB77為多氯聯(lián)苯的代表物，對(duì)PCB77的酶聯(lián)免疫吸附分析方法進(jìn)行研究，選擇具有活性基團(tuán)和PC

3、B77特異性結(jié)構(gòu)的3，4-二氯苯基乙酸作為半抗原，在低溫和弱堿性條件下，采用N-羥基琥珀酰亞胺活性酯法將其與載體BSA偶聯(lián)，制備PCB77的人工抗原，計(jì)算結(jié)合比為23:1，免疫家兔獲得了PCB77的多克隆抗體。經(jīng)瓊脂雙擴(kuò)散和間接ELISA檢測(cè)表明，其瓊脂雙擴(kuò)散的結(jié)果在1：16以上，ELISA測(cè)得效價(jià)在1：20000以上，符合ELISA分析技術(shù)建立對(duì)抗血清效價(jià)的要求，用辛酸-硫酸銨鹽法對(duì)抗血清進(jìn)行純化。采用混合酸酐法將半抗原與OVA偶聯(lián)，

4、其結(jié)合比為8：1，用作ELISA檢測(cè)包被原。 本研究從固相包被條件的選擇、最佳工作濃度的確定和基質(zhì)條件的優(yōu)化等方面初步得到間接ELISA分析方法的工作條件，并在優(yōu)化條件下建立PCB77檢測(cè)的間接ELISA方法，在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線中，抑制率與PCB77的濃度對(duì)數(shù)值呈顯著的線性關(guān)系，其回歸方程為Y=-0.1370Ln(x)+1.1043，可決系數(shù)R2=0.9930，其檢測(cè)范圍在0.75～300ng/L之間，最低檢測(cè)限IC10=4.44n

5、g/mL，初步鑒定抗體滿足實(shí)驗(yàn)檢測(cè)需要。 采用間接ELISA法對(duì)PCB77的結(jié)構(gòu)類似物進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗(yàn)，當(dāng)PCB77對(duì)抗原抗體反應(yīng)的抑制率為50％時(shí)，所需PCB77的濃度為82.16ng/mL，PCB126的濃度為270.43ng/mL，交叉率為30.4％，DCP的濃度為897.84ng/mL，交叉率為9.1％，2，4-D的濃度為2221.64ng/mL，交叉率為3.7％，三氯乙酸的濃度>8000ng/mL，交叉率<0.1％。

6、 以建立的ELISA檢測(cè)方法對(duì)添加在土壤和水樣中的樣品進(jìn)行回收，測(cè)定PCB77在土壤中的添加回收率為109～146％，三個(gè)平行的變異系數(shù)在5.00～11.77之間，在水樣中的添加回收率為84％～98％，三個(gè)平行樣的變異系數(shù)在2.84～7.75之間。 綜合分析，本研究成功制備了PCB77的人工抗原，經(jīng)動(dòng)物免疫獲得了高效價(jià)的抗血清，可用于建立PCB77的間接ELISA方法。經(jīng)優(yōu)化，建立了PCB77的標(biāo)準(zhǔn)曲線，與結(jié)構(gòu)類似物的交叉