用于毒素檢測的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)研究.pdf

1、轉(zhuǎn)基因蛋白Cry1Ab和黃曲霉毒素B1分別為最重要的轉(zhuǎn)基因作物成份和致癌性最強(qiáng)、天然發(fā)生的真菌毒素，皆關(guān)乎民生。開發(fā)針對這兩種毒素的快速檢測方法對于日益高漲的農(nóng)產(chǎn)品與食品安全檢測、環(huán)境監(jiān)測等需求有著十分重大的實用意義。本課題側(cè)重于方法學(xué)上的創(chuàng)新，Cry1Ab蛋白和AFB1分別為典型的大分子和小分子抗原，依此對象建立的新方法也可以相對容易地推廣到其它大分子和小分子分析物的檢測；為拓展到致病菌、農(nóng)藥小分子等檢測提供新的方法依據(jù)，服務(wù)于農(nóng)業(yè)、

2、食品、環(huán)境安全等。
　　 本課題綜合利用光學(xué)、免疫學(xué)、農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)、材料科學(xué)、納米技術(shù)、生物化學(xué)、有機(jī)化學(xué)和分析化學(xué)等諸多領(lǐng)域的知識，以大分子的內(nèi)毒素(轉(zhuǎn)基因蛋白Cry1Ab)和小分子的真菌毒素(黃曲霉毒素B1，AFB1)為對象，研究了用于毒素檢測的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)新方法。通過自制的納米磁珠和商業(yè)化的核酸純化系統(tǒng)，提升了免疫分析的自動化程度，建立了一種基于磁珠轉(zhuǎn)運的半自動ELISA(Mts-ELISA)；將Mts

3、-ELISA成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因蛋白Cry1Ab的檢測，為研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的高通量、自動化免疫分析儀器提供了方法依據(jù)。探索性地提出了ELISA檢測的新方式一夾心競爭法和基于聚合HRP酶信號放大的間接競爭法，為開發(fā)新型的ELISA試劑盒和診斷試紙等提供了理論依據(jù)。
　　 主要研究結(jié)果和結(jié)論為：
　　 (1)以甲胎蛋白(AFP)為模型，建立了一種基于磁珠轉(zhuǎn)運的半自動酶聯(lián)免疫測定(ELISA)方法，并與基于酶標(biāo)板的經(jīng)典ELIS

4、A和基于磁珠的手動磁ELISA進(jìn)行了比較。結(jié)果表明：通過水熱法自制的磁珠粒徑均勻，直徑約440 nm，經(jīng)硅層包裹和氨基化修飾后仍保有良好的磁響應(yīng)能力；用戊二醛兩步法鏈接的抗體和氨基化磁珠(20 mg/mL)的最優(yōu)比例為20μg抗體/75μL磁珠；將商業(yè)化核酸純化系統(tǒng)中的磁珠轉(zhuǎn)運功能用于實現(xiàn)磁免疫分析的自動化是可行的，由此建立了一種靈敏的、基于磁珠轉(zhuǎn)運的半自動ELISA(Mts-ELISA)；Mts-ELISA的靈敏度(0.104 OD·

5、mL/ng)高于經(jīng)典ELISA，且更加省時省力，檢測時間為50 min，Mts-ELISA與手動磁ELISA靈敏度相當(dāng)，但更省時省力，能實現(xiàn)高通量檢測。
　　 (2)建立了Mts-ELISA檢測轉(zhuǎn)基因蛋白Cry1Ab。結(jié)果表明：水熱法制備的440 nm磁珠具有順磁性，飽和磁化率為56.8 emu g-1；將Mts-ELISA從以AFP蛋白為模型的直接夾心體系擴(kuò)展到檢測Cry1Ab蛋白的間接夾心體系是可行的；Mts-ELISA檢測

6、Cry1Ab的總時間不超過2h，能夠檢測出低至1 ng/mL的Cry1Ab蛋白，與商業(yè)化的Cry1Ab蛋白ELISA試劑盒檢測性能相當(dāng)。
　　 (3)提出了一種用于小分子檢測的ELISA新方式一夾心競爭法，并與傳統(tǒng)的直接競爭法進(jìn)行了系統(tǒng)比較。結(jié)果表明：1)將AFB1蛋白偶聯(lián)物(BSA-AFB1)當(dāng)作一個整的大分子抗原，而把其上面連有的小分子AFB1當(dāng)成這個新抗原大分子的新表位，使用相同的AFB1單克隆抗體對BSA-AFB1進(jìn)行夾

7、心檢測是可行的；采用生物素標(biāo)記的AFB1抗體來作為二抗時，該夾心法對BSA-AFB1的檢測限為0.05 ppb。2)在夾心檢測BSA-AFB1的基礎(chǔ)上，引入自由的AFB1可以實現(xiàn)對BSA-AFB1信號的抑制，從而實現(xiàn)了對小分子AFB1的夾心競爭檢測；3)對AFB1抗體進(jìn)行生物素標(biāo)記或酶標(biāo)記作為二抗，都能實現(xiàn)夾心競爭法檢測AFB1；采用酶標(biāo)記抗體的夾心競爭法檢測時間更短，所得校正曲線的背景噪聲和變異系數(shù)小，優(yōu)于采用生物素標(biāo)記的抗體；4)經(jīng)

8、優(yōu)化的夾心競爭法(第二批次的酶標(biāo)記抗體，1:1000稀釋；一抗?jié)舛龋? ppm；夾心BSA-AFB1濃度，100 ppb)和直接競爭法(包被BSA-AFB1濃度，100 ppb；第二批次的酶標(biāo)記抗體，1:1000稀釋)在靈敏度、IC50和線性范圍等性能上相當(dāng)，夾心競爭法的IC50為0.06～0.07 ppb，檢出限為19.4 ppt，線性范圍為34.1～166.6 ppt；直接競爭法的IC50也為0.06～0.07 ppb，檢出限為29

9、.0 ppt，線性范圍為40.2～135.8 ppt。5)夾心競爭法的組內(nèi)(intra-assay)和組間(inter-assay)變異系數(shù)(CV)分別為4.9～19.3％和3.6～16.8%；直接競爭法的組內(nèi)和組間變異系數(shù)(CV)分別為6.1～11.5%和4.2～9.9%。
　　 (4)引入了聚合辣根過氧化物酶(PolyHRP)作為信號分子進(jìn)行信號放大，建立了基于生物素標(biāo)記的黃曲霉毒素抗體(bioAb)和連有聚合HRP酶的鏈霉

10、親和素(Streptavidin-PolyHRP40，SA)的bioAb-SA間接競爭法，并和傳統(tǒng)間接競爭法進(jìn)行了系統(tǒng)比較。結(jié)果表明：1)bioAb-SA間接競爭法優(yōu)化后的最優(yōu)濃度組合為bioAb-SA(0.005-0.025 ppm)。2)傳統(tǒng)競爭法中作為檢測抗體(detection antibody，DeAb)的黃曲霉毒素單抗和作為示蹤抗體(Tracer antibody，TrAb)的酶標(biāo)記抗鼠IgG抗體的優(yōu)化后最優(yōu)濃度組合為DeA

11、b-TrAb(0.005-0.2 ppm)。3)系統(tǒng)比較了兩體系(bioAb-SA和DeAb-TrAb)最優(yōu)濃度條件下檢測不同基質(zhì)中AFB1的性能參數(shù)。
　　 結(jié)果表明：bioAb-SA(0.005-0.025 ppm)體系下在PBS、MeOH/PBS和大麥基質(zhì)中所得校正曲線的IC50分別為4.1 ppt、8，0 ppt和12.5 ppt，檢測限LOD分別為0.7 ppt、1.3 ppt和0.8 ppt，其最大信號(0.D.)m

12、ax分別為1.12、1.27和1.27；DeAb-TrAb(0.005-0.2 ppm)體系下在PBS、MeOH/PBS和大麥基質(zhì)中所得校正曲線的IC50分別為4.2 ppt、4.4 ppt和6.8 ppt，檢測限LOD分別為2.1 ppt、0.7 ppt和2.8 ppt，最大信號(0.D.)max分別為0.52、0.55和0.40。bioAb-SA和DeAb-TrAb體系下的IC50和LOD相當(dāng)，但前者的靈敏度是后者的2～3倍；對比發(fā)