沙丁胺醇單克隆抗體的制備及其免疫檢測(cè)方法的初步建立.pdf

1、沙丁胺醇(Salbutamol,Sal),又名舒喘寧,為選擇性β2受體激動(dòng)劑。對(duì)動(dòng)物具有促進(jìn)骨骼肌(瘦肉)生長(zhǎng),減少脂肪蓄積等作用。常在豬、牛、雞等畜禽的生產(chǎn)中非法用作促生長(zhǎng)劑,可提高飼料轉(zhuǎn)化率、增加瘦肉產(chǎn)量。但是,食品中沙丁胺醇的殘留能引起心悸、頭疼、目眩、呼吸困難,嚴(yán)重影響人們的健康。另外,檢測(cè)沙丁胺醇?xì)埩舻募夹g(shù)手段也相對(duì)滯后。因此,一些不法分子為謀取經(jīng)濟(jì)利益,在養(yǎng)殖場(chǎng)非法使用沙丁胺醇代替“瘦肉精”克倫特羅作為促生長(zhǎng)劑。
　　

2、 目前,檢測(cè)沙丁胺醇的方法有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)以及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。GC-MS、HPLC和LC-MS方法準(zhǔn)確可靠,但樣品前處理繁瑣,對(duì)儀器設(shè)備以及操作過(guò)程的要求較高,不適于生產(chǎn)、基層單位及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。ELISA檢測(cè)是一種基于抗原抗體反應(yīng)和酶化學(xué)反應(yīng)的檢測(cè)方法,具有快速、靈敏、操作簡(jiǎn)單和一次檢測(cè)樣品量大的特點(diǎn),而且不需要復(fù)雜昂貴的的儀器設(shè)備,對(duì)操

3、作者的專(zhuān)業(yè)要求也比較低。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Sal與琥珀酸酐的醇解反應(yīng)制備Sal的琥珀酸衍生物,用碳二亞胺法將Sal琥珀酸衍生物偶聯(lián)到載體蛋白牛血清白蛋白和卵清白蛋白上,合成為完全抗原Sal-HS-BSA和Sal-HS-OVA。通過(guò)紫外掃描(UV)和SDS-PAGE進(jìn)行鑒定,確認(rèn)沙丁胺醇已經(jīng)連接到載體蛋白上,偶聯(lián)比分別為7.7:1和8.8:1。用Sal-HS-BSA作為免疫原免疫BALB／C小鼠,間接ELISA方法檢測(cè)小鼠血清抗體

4、效價(jià),抗體效價(jià)均達(dá)到了1:103-104。
　　 選擇免疫效果最好(抗體效價(jià)為1:2.56×104,IC50最低為270 ng／ml)的小鼠,取其脾細(xì)胞與SP2／0進(jìn)行細(xì)胞融合,平均每孔有1-2株融合細(xì)胞生長(zhǎng),融合率為100％。經(jīng)陽(yáng)性細(xì)胞亞克隆后,獲得6株雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞株,分別測(cè)定其IC50,篩選出2株高效價(jià)、敏感、特異的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為2D9和1C4。將篩選得到的2D9和1C4雜交瘤細(xì)胞分別注射到成年Balb／c小鼠腹

5、腔,收集腹水,經(jīng)辛酸-硫酸銨法純化后,蛋白含量為3.6mg／ml,純度達(dá)78％-86％。經(jīng)間接ELISA效價(jià)檢測(cè),2D9雜交瘤細(xì)胞株的細(xì)胞培養(yǎng)上清液和腹水抗體效價(jià)分別為1:2.56×104和1:4.096×106;1C4雜交瘤細(xì)胞株的細(xì)胞培養(yǎng)上清液和腹水抗體效價(jià)分別為1:1.28×104和1:2.048×105。經(jīng)抗體亞型鑒定,2D9和1C4細(xì)胞株所分泌的抗體均為IgG1。
　　 采用阻斷ELISA法測(cè)定抗Sal單克隆抗體的敏感

6、性和特異性。兩株抗體IC50值約為6.25 ng／ml,表明抗Sal單克隆抗體對(duì)Sal具有較高的敏感性。檢測(cè)抗Sal單克隆抗體與載體蛋白(BSA、OVA)、沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、異丙腎上腺素和去甲腎上腺素的交叉反應(yīng)性,根據(jù)交叉反應(yīng)率(Cross reaction,CR)判定抗Sal單克隆抗體對(duì)鹽酸克倫特羅有26.09％的交叉反應(yīng)性,對(duì)載體蛋白(BSA、OVA),萊克多巴胺等其它腎上腺激素類(lèi)無(wú)交叉反應(yīng),說(shuō)明所制備的抗Sal單

7、克隆抗體具有很高的特異性。
　　 本研究獲得了高效價(jià)、敏感、特異性的抗Sal抗體,并以抗單克隆抗體2D9為基礎(chǔ),初步確立了Sal殘留免疫學(xué)檢測(cè)方法,同時(shí)對(duì)相關(guān)條件如Sal-OVA包被條件、酶標(biāo)抗體最佳使用濃度、酶標(biāo)抗體最佳反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化,應(yīng)用間接競(jìng)爭(zhēng)EIASA方法建立了檢測(cè)Sal殘留的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),曲線(xiàn)回歸方程為y=-32.595x+48.1(R2=0.9841),靈敏度和最低檢出限為別為1.14 ng／ml和0.15 ng／m