副雞嗜血桿菌單克隆抗體的制備及阻斷ELISA檢測方法的初步建立.pdf

1、副雞嗜血桿菌是雞傳染性鼻炎(IC)的病原，該菌培養(yǎng)條件苛刻、分離困難，發(fā)病雞病癥不典型，加大了臨床診斷和實驗室檢測的難度。本研究旨在研制出該細(xì)菌種特異性單抗，并在此基礎(chǔ)上建立起特異性較強、敏感性較好的檢測方法。 本研究以副雞嗜血桿菌A型Hpg14和C型株Hpg668經(jīng)0.01％硫柳汞滅活后作為抗原，4次免疫8周齡BALB/c小鼠后，取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0-Ag-14進行融合。通過間接ELISA．和直接平板凝集試驗進行

2、篩選，將獲得的陽性細(xì)胞株進行亞克隆，篩選穩(wěn)定分泌單克隆抗體的細(xì)胞株。經(jīng)3次亞克隆后共獲得9株針對副雞嗜血桿菌特異性單抗，其中8株是針對副雞嗜血桿菌種特異性的，分別命名為3D3、1D6、5C9、4C3、4G11、6G2、5D2和1E8；1株是針對該細(xì)菌C型的，命名為1F5。以上單抗腹水的間接ELISA效價在6×10<'3>～1×10<'5>之間，直接平板凝集試驗效價在2<'3>～2<'6>。免疫球蛋白亞類試劑盒鑒定結(jié)果表明：4C3、4G1

3、1和6G2屬于IgG<,1>亞類，1E8為IgG3亞類，3D3、5C9和1F5屬于IgM亞類，而1D6屬于IgG<,2a>亞類。 特異性實驗結(jié)果表明：該9株單抗只與副雞嗜血桿菌反應(yīng)，而不與巴氏桿菌、禽嗜血桿菌、放線桿菌發(fā)生交叉反應(yīng)，顯示出很好的種特異性；單抗1F5與A型的副雞嗜血桿菌有輕微交叉反應(yīng)，顯示出較好的型特異性。 9株單抗與4個已分型的菌株和3個未定型的分離株共7株副雞嗜血桿菌的排譜反應(yīng)表明：3D3、1D6、5C

4、9、4C3、4G11、6G2、5D2和1E8有較好的廣譜性；1F5能與非抗原的C型菌株發(fā)生反應(yīng)。本研究在研制出副雞嗜血桿菌的特異性單克隆抗體的基礎(chǔ)上建立了能檢測副雞嗜血桿菌特異性抗體的阻斷ELISA方法，并應(yīng)用此方法對8種常見病原體的陽性血清及多份免疫雞、人工感染雞血清和陰性血清進行了檢測，結(jié)果證明，本方法具有較好的特異性和敏感性，而且操作簡便、快速，是一種適用于雞傳染性鼻炎的診斷、流行病學(xué)調(diào)查、檢疫和監(jiān)測的有效方法。這為有效控制該病提