重金屬鋅離子單克隆抗體的制備及阻斷ELISA檢測方法的建立.pdf

1、重金屬鋅（Zn）是動物體內不可或缺的元素，因此各類動物性食品中都含有鋅。鋅是人體含量最多的微量元素，其含量高達3g之多，主要以鋅離子的形式參與體內的代謝，參與人體內200多種酶的合成與活化，是機體新陳代謝中必不可少的物質。鋅離子通過參與體內蛋白質的合成來促進體內細胞的分裂、生長和再生，從而影響兒童和青少年的生長發(fā)育。
　　人體缺鋅時會引起一系列的生理現象紊亂，包括組織器官的生理功能異常。如生長發(fā)育不良、食欲不振、智力發(fā)育差等，同時

2、味覺和視覺也會受影響。
　　鋅與其它元素在人體內的比例與人的健康關系很大。當鋅銅比值過大時易發(fā)生高血壓、冠心病。鋅鉬比值過大則預示著癌癥晚期。
　　人體攝入鋅的量過多時，會造成人體鋅中毒，出現嘔吐、腹瀉，損害肝、腎、血管和心臟功能，甚至造成死亡。因此研發(fā)一種快速、高效的方法去檢測食品和環(huán)境中重金屬鋅離子的含量來保證食品安全顯得尤為重要。
　　本文主要采用分子偶聯技術、細胞融合技術、免疫酶技術，建立重金屬鋅離子的一種新的

3、免疫檢測方法。
　　通過采用異硫氰酯法用異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸（ITCBE）將 Zn2+和 BSA偶聯形成完全抗原 Zn2+-ITCBE-BSA。同理，使用相同的方法螯合 Zn2+和 OVA形成包被原Zn2+-ITCBE-OVA。通過核酸蛋白分析儀、SDS-PAGE電泳、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法和免疫小鼠后多抗血清的ELISA鑒定：免疫原與包被原的蛋白濃度分別為8.48 mg/mL和9.23 mg/mL；Zn2+含量分別為

4、101.1μg/mL和90.09μg/mL；間接ELISA效價達到1:1.28×104，阻斷ELISA檢測Zn2+-EDTA的半數抑制濃度（IC50）為26.85 ng/mL，與EDTA及其它金屬離子螯合物無交叉反應。
　　采用背部多點注射免疫法將Zn2+-ITCBE-BSA免疫Balb/C小鼠5只，5次免疫后，用間接ELISA方法和阻斷ELISA方法進行檢測篩選出備用融合小鼠。通過細胞融合技術，間接ELISA方法和阻斷ELISA

5、方法篩選出2B3D8、2A11E1和4B6C4共3株敏感特異的雜交瘤細胞株，用體內誘生腹水法制備Zn2+-EDTA mAb，間接ELISA檢測其細胞培養(yǎng)上清效價分別為1:2.56×103、1:1.28×103、1:2.56×103，腹水效價分別為1:2.26×105、1:1.18×104、1:1.18×105，同種型分別為IgG1/κ、IgG1/κ、IgG1/λ，其中特異性最好的2B3D8株，其IC50為26.85μg/L，與其它金屬離

6、子螯合物無交叉反應。本試驗制備的Zn2+-EDTA pAb和Zn2+-EDTA mAb均可用于Zn2+污染的免疫學檢測，其中Zn2+-EDTA mAb效果更好。
　　應用Zn2+-EDTA mAb研制出Zn2+污染快速檢測試劑盒（Zn2+-Kit），用阻斷ELISA測其靈敏度，添加回收試驗測其準確度，批內批間試驗測其精確度，交叉反應試驗測其特異性。試劑盒靈敏度為7.46 ng/mL，添加回收試驗和批內批間試驗的變異系數均小于15％