抗牛IFN-γ單克隆抗體制備及ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、γ干擾素（IFN-Y）主要由被抗原、有絲分裂素（ConA,PHA）等活化的Th<，1>細(xì)胞、CD8<'＋>細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，除具有抗病毒、抗腫瘤活性外，還具有免疫調(diào)節(jié)作用，如活化巨噬細(xì)胞、提高M(jìn)HCI類和Ⅱ類分子的表達(dá)、促進(jìn)抗原提呈等，在機(jī)體免疫控制和免疫病理中起著重要的作用。研究表明，外源性的IFN-γ既可以作為藥劑用于感染性疾病或腫瘤等的治療，又可以作為免疫佐劑，增強(qiáng)疫苗的免疫效果；內(nèi)源性IFN-γ水平的高低在很大程度上可以反映機(jī)

2、體的細(xì)胞免疫狀態(tài)，而抗原特異性的IFN-γ反應(yīng)則可以作為機(jī)體針對(duì)某種特定外來抗原的細(xì)胞免疫狀態(tài)的指標(biāo)。對(duì)應(yīng)，抗IFN-γ的單克隆抗體（McAb）作為研究、檢測(cè)IFN-γ的手段，在免疫機(jī)制研究、免疫功能檢測(cè)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。IFN-γ的免疫學(xué)檢測(cè)（IFN-γ試驗(yàn)）是在特異性抗IFN-γMcAb的基礎(chǔ)上建立的用于對(duì)樣本中的IFN-γ進(jìn)行定性定量分析的實(shí)驗(yàn)方法，已被廣泛地用于基礎(chǔ)研究和臨床免疫學(xué)、疫苗免疫效果評(píng)估、器官移植、過敏反應(yīng)以及胞

3、內(nèi)病原感染的診斷等。IFN-γ及其McAb在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域也有著廣泛的應(yīng)用。國外已有學(xué)者將基因重組牛IFN-γ（rBovlFN-γ）及其McAb用于牛病的研究，抗原特異性的牛IFN-γ試驗(yàn)已在很多發(fā)達(dá)國家被用于多種牛疫病的檢測(cè)，尤以在牛結(jié)核病診斷中的應(yīng)用最為廣泛，相關(guān)的研究也最為深入，國內(nèi)這方面研究的報(bào)道比較少。最近幾年來，隨著基因克隆、重組、表達(dá)及單克隆技術(shù)的不斷發(fā)展、成熟，通過基因工程手段制備rBovIFN-γ并在此基礎(chǔ)上制備其McA

4、b成為可能。本實(shí)驗(yàn)克隆并表達(dá)BovIFN-γ，制備抗牛IFN-γ單克隆及多克隆抗體，建立可檢測(cè)牛IFN-γ的雙抗體夾心間接ELSA方法。 1．BovIFN-γ在大腸桿菌中的表達(dá)及其產(chǎn)物的鑒定 通過PFIA刺激，從全血培養(yǎng)上清提取BovIFN-γmRNA，根據(jù)BovIFN-γ基因的已知序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過RT-PCR擴(kuò)增出BovIFN-γcDNA，定向插入原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a（+），構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)，轉(zhuǎn)

5、化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)出大小在22kDa左右的蛋白；并對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。 2．rBovIFN-γ McAb的制備與鑒定 本研究以純化的原核表達(dá)融合蛋白BovIFN-γ為免疫原，應(yīng)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，研制出4株穩(wěn)定分泌抗BovIFN-γ單克隆抗體的細(xì)胞株，分別命名為A7、A10、G6、G10，免疫球蛋白亞類鑒定都為IgG<，1>，腹水效價(jià)為1:2<'9>×100、1:2<'10>×100、1:2<'

6、9>×100、1:2<'9>×100，Western-blot分析顯示，4株單抗均能特異性結(jié)合22kDa的BovlFN-γ，ELISA試驗(yàn)表明，4株單抗只與融合蛋白BovlFN-γ反應(yīng)，而不與Ag85B、ESAT-6-CFP-10、GM-CSF反應(yīng)，表明4株單抗均為針對(duì)BovlFN-γ的特異性單抗。 3．雙抗體夾心間接ELISA方法建立 選取單抗A10、純化的多克隆抗體及辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔酶標(biāo)二抗，建立