抗GNA兔單克隆抗體的制備及其夾心ELISA檢測(cè)體系的建立.pdf

1、雪花蓮凝集素(Galanthus nivalis agglminim，GNA)對(duì)咀嚼式害蟲(chóng)和刺口式吸汁性害蟲(chóng)具有毒殺性能而且對(duì)高等動(dòng)物相對(duì)安全，作為Bt蛋白、胰蛋白酶抑制劑等殺蟲(chóng)毒蛋白的功能互補(bǔ)和增強(qiáng)成分，成為植物基因工程中應(yīng)用最廣泛的植物外源凝集素。目前，對(duì)轉(zhuǎn)基因GNA蛋白的檢測(cè)主要集中在基于DNA分子的遺傳學(xué)檢測(cè)。酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)技術(shù)能夠?qū)χ苯雨P(guān)乎轉(zhuǎn)基因

2、食品安全的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，而且ELISA技術(shù)具有快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，適用于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩查。兔單克隆抗體(monoclonal antibody，McAb)制備技術(shù)是目前相對(duì)較先進(jìn)的生物技術(shù)之一。兔單克隆抗體技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因食品蛋白的檢測(cè)國(guó)內(nèi)外未曾有相關(guān)報(bào)道。兔單克隆抗體相較于鼠單克隆抗體，具有能識(shí)別更多的新型表位、更高的親和性和更強(qiáng)的特異性等優(yōu)點(diǎn)。本研究擬通過(guò)獲得高質(zhì)量雜交瘤細(xì)胞的基礎(chǔ)上，運(yùn)用抗體重組技術(shù)獲得兔單克隆抗體，以使收集

3、得到的兔單克隆抗體的免疫捕獲能力進(jìn)一步提高最終建立一種檢測(cè)GNA蛋白的基于兔單克隆抗體雙抗夾心ELISA檢測(cè)體系。其主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 (1)抗GNA兔多克隆抗體的制備及鑒定
　　 運(yùn)用SDS-PAGE凝膠電泳對(duì)GNA免疫抗原蛋白的分子量和純度進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，GNA蛋白分子量約為14.3KDa，且純度較高，可作為獨(dú)立的抗原引起機(jī)體的免疫反應(yīng)。用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)得GNA蛋白的濃度為1.64 mg/mL

4、。采用免疫技術(shù)，將GNA蛋白與等量弗氏完全佐劑乳化后注射入兩只兔子(B3365，B3366)體內(nèi)。經(jīng)五次免疫之后選擇免疫效價(jià)較高的兔子(B3366)，取全血，經(jīng)Sepharose CL-4B Protein A柱分離純化兔多抗血清，并對(duì)其純度和效價(jià)分別進(jìn)行凝膠電泳和間接ELISA檢測(cè)。結(jié)果表明，所獲得的抗GNA兔多克隆抗體純度較高，幾乎不含其它雜蛋白，效價(jià)在8000～32000之間。
　　 (2)抗GNA兔單克隆抗體的制備及鑒定

5、
　　 免疫兩只兔子(B3365，B3366)，選取效價(jià)較高的B3366號(hào)兔子的脾臟進(jìn)入細(xì)胞融合階段。將兔子脾臟淋巴細(xì)胞與240E骨髓瘤細(xì)胞融合。運(yùn)用間接ELISA法，經(jīng)過(guò)初篩復(fù)篩，獲得雙陽(yáng)性克隆子6個(gè)(zju-17-2、Zju-17-3、zju-17-5、zju-17-6、zju-17-14、zju-17-17)，取其中三個(gè)(zju-17-3、zju-17-5、zju-17-6)進(jìn)入抗體質(zhì)粒重組階段，選取分泌單克隆抗體能力強(qiáng)且

6、抗體親和性高的配對(duì)(ziu-17-5(2L/2H))，進(jìn)入單克隆抗體的大轉(zhuǎn)生產(chǎn)，最后將收集到的抗GNA兔單克隆抗體經(jīng)SepharoseCL-4B Protein A柱分離純化。
　　 經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析，證實(shí)了該兔單克隆抗體的純度高，運(yùn)用IgG檢測(cè)技術(shù)和間接ELISA檢測(cè)技術(shù)，分別獲得該目標(biāo)抗體的初始濃度為2.28mg/mL，效價(jià)在32000～128000之間，親和常數(shù)為0.387×109L/mol。
　　

7、(3)檢測(cè)GNA夾心ELISA體系的建立和應(yīng)用
　　 用生物素標(biāo)記的兔多克隆抗體，其標(biāo)記率為2.40、抗體濃度為7.67×10-6mol/L、生物素濃度為1.84×10-5mol/L。
　　 經(jīng)過(guò)嘗試，確立的雙抗夾心ELISA法是用4μg/mL抗GNA兔單克隆抗體作為一抗包被酶標(biāo)板，二抗是稀釋20倍的生物素標(biāo)記的兔多克隆抗體。酶標(biāo)抗生物素稀釋400倍后加入，經(jīng)顯色9min，終止后測(cè)OD450。其中，GNA蛋白、生物素標(biāo)記

8、兔多抗和酶標(biāo)抗生物素的稀釋均用3％的脫脂牛奶。用該雙抗夾心ELISA法檢測(cè)GNA蛋白，檢測(cè)限(LOD)可達(dá)3.9～7.8 ng/mL，其線(xiàn)性檢測(cè)范圍為0.975～62.5 ng/mL。
　　 為了驗(yàn)證該雙抗夾心ELISA檢測(cè)體系的實(shí)用性，將該方法應(yīng)用于轉(zhuǎn)GNA基因稻米的檢測(cè)。通過(guò)對(duì)稻米進(jìn)行預(yù)處理，再用雙抗夾心ELISA法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，并設(shè)置陰性對(duì)照和空白對(duì)照，同時(shí)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)GNA基因樣品的OD450(0.41