豬圓環(huán)病毒2型單克隆抗體研制與夾心ELISA抗原檢測(cè)方法的建立.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是引起世界養(yǎng)豬國家經(jīng)濟(jì)損失的重要病原之一。PCV2感染與臨床多種綜合征疾病有關(guān)，這些疾病被統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(PCVAD)或豬圓環(huán)病毒病(PCVD)。PCV2是一個(gè)無囊膜單股環(huán)狀DNA病毒，PCV2基因組上有4個(gè)開放性閱讀框ORF1～4，其中ORF1～3編碼病毒非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白，即Cap蛋白。Cap蛋白是病毒的主要免疫原性蛋白，在抗病毒感染免疫中發(fā)揮著重要作用。本研究以純化的PCV2病

2、毒粒子為免疫原，成功篩選出針對(duì)PCV2Cap蛋白單克隆抗體，并利用其中的一株單抗和制備的兔多抗血清建立了檢測(cè)PCV2的夾心ELISA抗原檢測(cè)方法，為PCV2診斷和病毒蛋白功能研究提供了重要工具。本研究的具體內(nèi)容如下:
　　1.PCV2單克隆抗體的制備與鑒定
　　本研究利用純化的豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)免疫Balb/c小鼠，通過單克隆抗體技術(shù)，篩選獲得3株能穩(wěn)定分泌抗PCV2Cap蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為3E5、3

3、E6和5A6。體外培養(yǎng)連續(xù)傳代至第20代，分泌抗體的效價(jià)基本一致。3E5、3E6和5A6培養(yǎng)的上清效價(jià)分別為1∶12800、1∶1600和1∶6400，腹水效價(jià)為1∶6400000、1∶640000和1∶800000;3株單抗亞類與型鑒定，重鏈均為IgG2a亞類，輕鏈為κ型;間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示，3株單抗均可與PCV2產(chǎn)生特異性熒光反應(yīng);病毒中和試驗(yàn)顯示，3E5和3E6均具有良好的中和活性，而5A6不具有中和活性;Westernbl

4、ot結(jié)果表明，3株單抗均可與PCV2Cap蛋白（約30kDa）發(fā)生特異性反應(yīng)，其識(shí)別的表位需要Cap蛋白N端42～50aa區(qū)域某些氨基酸的參與。這些單抗的制備為PCV2抗原表位分析及分子診斷提供了技術(shù)手段。
　　2.PCV2夾心ELISA抗原檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用
　　本研究利用PCV2單克隆抗體3E5作為捕獲抗體，兔抗PCV2血清為第一抗體，成功建立了PCV2夾心ELISA抗原檢測(cè)方法，其優(yōu)化的反應(yīng)條件為:單抗包被濃度為

5、2μg/mL，37℃包被2h;用含5％脫脂乳的磷酸鹽緩沖液封閉，37℃作用1h;待檢抗原稀釋度應(yīng)在1∶2以上，37℃作用2h;兔抗PCV2血清1∶8000稀釋，37℃作用1h;羊抗兔IgG-HRP稀釋度1∶10000，37℃作用0.5h;TMB顯色時(shí)間為37℃作用10min。判定標(biāo)準(zhǔn)為:樣品的OD450nm值≥0.209時(shí)為陽性，樣品OD450nm值＜0.191時(shí)為陰性，介于0.191～0.209之間為可疑。該ELISA方法與豬圓環(huán)病毒

6、1型(PCV1)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬巨細(xì)胞病毒(PCMV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬腦心肌炎病毒(EMCV)及副豬嗜血桿菌(Hps)等均無交叉反應(yīng)性。檢測(cè)PCV2細(xì)胞毒，其最低檢測(cè)下限為102.59TCID50/mL;批內(nèi)和批間試驗(yàn)顯示其變異系數(shù)均小于10％，說明該ELISA方法具有較高特異性、敏感性和重復(fù)性。采用倍比稀釋PCV2標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制病毒抗原定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)范圍為390.6～25000TCI

7、D50/mL，相關(guān)系數(shù)r值為0.99。應(yīng)用該方法定量檢測(cè)6份細(xì)胞毒樣品中PCV2含量，結(jié)果與間接免疫熒光法測(cè)得的病毒TCID50相似;該方法與經(jīng)β-丙內(nèi)酯滅活的PCV2細(xì)胞毒、真核表達(dá)的PCV2Cap蛋白均可有效反應(yīng)，但不能與甲醛滅活的PCV2抗原反應(yīng)。用該方法檢測(cè)臨床發(fā)病豬淋巴結(jié)組織樣品中PCV2含量，發(fā)現(xiàn)仔豬表現(xiàn)PMWS的臨床癥狀與其組織中PCV2的病毒含量有明顯的正相關(guān)性。以上結(jié)果表明該方法在應(yīng)用于PCV2含量檢測(cè)和PCVAD診斷