NT-proBNP單克隆抗體的研制及ELISA定量檢測(cè)方法的建立.pdf

1、目的：心衰是導(dǎo)致多數(shù)心臟病人死亡的最終發(fā)展階段，嚴(yán)重影響了患者的生命健康。因此，如何在心衰發(fā)病的早期及時(shí)診斷、指導(dǎo)臨床醫(yī)生盡早開(kāi)展抗心衰的治療一直是人們研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)：N端前腦鈉肽（NT-proBNP）是判定心衰進(jìn)程、發(fā)展的主要標(biāo)志物，其含量變化可敏感及特異地反應(yīng)心室功能的變化和心臟功能的損傷及損傷程度。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于NT-proBNP檢測(cè)產(chǎn)品技術(shù)的研究處于起步階段，所需抗體等主要材料大多依賴(lài)進(jìn)口。因此，本研究擬通過(guò)制備抗NT-pr

2、oBNP單克隆抗體、并以此為基礎(chǔ)建立一種檢測(cè)人血清中N端前腦鈉肽含量的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法來(lái)推動(dòng)國(guó)內(nèi)該疾病檢測(cè)方法的進(jìn)步。
　　方法：1.將 NT-proBNP抗原免疫 BABL/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合、陽(yáng)性細(xì)胞株篩選制備N(xiāo)T-proBNP單克隆抗體。用分別與OVA耦聯(lián)的線性表位片段18～38、35～50、55～72篩選確定所得單抗針對(duì)的線性表位，并通過(guò)間接ELISA特異性分析及亞型分析方法對(duì)所得單抗進(jìn)行特異性及亞型鑒定。

3、r>　　2.通過(guò)雙抗體夾心ELISA法對(duì)所得單抗篩選獲取配對(duì)單抗，并以此為基礎(chǔ)通過(guò)包被與封閉條件、包被與酶標(biāo)抗體工作濃度、反應(yīng)模式、室內(nèi)質(zhì)控品及標(biāo)準(zhǔn)品的建立、線性范圍、批內(nèi)、批間精密性、回收率、干擾因素等方面的研究，建立人N端前腦鈉肽ELISA定量檢測(cè)方法。
　　結(jié)果：1.共獲得15株單克隆抗體。單抗亞型及表位鑒定顯示：10株為IgG1亞型，這10株中有5株針對(duì)18～38線性表位，2株抗體針對(duì)35～50線性表位，3株抗體針對(duì)55～

4、72線性表位，且與心衰相關(guān)標(biāo)志物均無(wú)交叉反應(yīng)。其中，5E10和5G5抗體配對(duì)。另外5株不是針對(duì)特異性表位抗原的單克隆抗體，舍棄。
　　2.本實(shí)驗(yàn)建立的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的條件為：包被抗體濃度為4μg/mL，酶標(biāo)稀釋倍數(shù)為1:3000；反應(yīng)模式為兩步法反應(yīng)模式：37℃樣本孵育30min，酶標(biāo)孵育30min，顯色20 min。
　　3.建立的NT-proBNP檢測(cè)方法：線性范圍為50～500 pg/mL，批內(nèi)及批間精密

5、性分別為2.3％和3.4%。低值、中值及高值的回收率分別為93.7%、97.2%、101.2%。干擾因子脂血、黃疸及低濃度溶血等對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)影響。用200份臨床血清測(cè)試，該試劑臨床總符合率為96.9%，用48份與國(guó)外試劑盒平行測(cè)試，結(jié)果表明兩者具有相關(guān)性，回歸方程：Y=0.8017X+188.3，R2=0.9027。
　　結(jié)論：1.利用單抗制備技術(shù)成功制備出10株NT-proBNP單抗，并篩選出1對(duì)最優(yōu)的NT-proBNP檢測(cè)用配