PRRSV重組N蛋白ELISA檢測方法的建立及單克隆抗體的制備.pdf

1、豬繁殖與呼吸障礙綜合征（PorcineReproductiveandRespirationSyndrome，PRRS）是目前引起豬場繁殖障礙的主要疫病之一，PRRSV基因組中一共有6種結(jié)構(gòu)蛋白基因，分別由ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7基因編碼病毒的GP2、GP3、GP4、GP5、M蛋白和N蛋白，其中N蛋白為本病毒的優(yōu)勢結(jié)構(gòu)蛋白，而且該蛋白具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性，為診斷PRRS的首選蛋白。本研究利用原核表

2、達系統(tǒng)對PRRSVN蛋白基因進行了高效可溶性表達，并用重組的N蛋白作為抗原，成功地建立了檢測PRRSV血清抗體的N蛋白間接ELISA方法和抗組氨酸標(biāo)簽單克隆抗體的細(xì)胞株。 利用基因工程方法將N蛋白基因亞克隆到原核表達載體PET32a中構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒PET32a-N，進行擴增培養(yǎng)，在IPTG的誘導(dǎo)下成功表達，獲得了大小約為33KD的融合蛋白N-His，與預(yù)期結(jié)果相符；表達量約占細(xì)菌總蛋白量的29％。應(yīng)用鎳瓊脂糖凝膠樹脂層折柱純

3、化重組N-His融合蛋白，純化的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳和Westernblot鑒定，目的蛋白純度高達91％，并具有良好的免疫原活性。 同時利用重組N-His融合蛋白作為包被杭原，通過優(yōu)化各步反應(yīng)條件，建立了可從豬血清中檢測豬繁殖與呼吸綜合征抗體的重組N蛋白間接ELISA方法。并將所建立的N-ELISA方法與國外進口的PRRS檢測試劑盒IDEXX-ELISA對163份臨床送檢血清進行平行檢測，二者陽性陽性符合率為83．9％

4、，陰性符合率為84．2％，總符合率達到84％，表明所建立的N-ELISA具有較好的特異性和敏感性。 將融合表達產(chǎn)物N-His按120μg/只的劑量與等量弗氏佐劑乳化，經(jīng)皮下免疫BALB/c小鼠3次后，取脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進行融合，以融合蛋白N-His為包被抗原，通過建立間接ELISA方法對融合細(xì)胞的上清液進行初步檢測，再用PRRSV全病毒包被建立的ELISA方法進行二次檢測，篩選陽性克隆，經(jīng)三次亞克隆后得到了2株能穩(wěn)定