頭孢曲松單克隆抗體的制備及ELISA方法的初步建立.pdf

1、頭孢曲松(Ceftraxone，CTRX)是第三代頭孢類抗生素，其抗菌譜廣，抑菌能力強(qiáng)，常被用于動(dòng)物感染性疾病的治療。頭孢曲松的濫用，易導(dǎo)致人與動(dòng)物多種系統(tǒng)的疾病，以過敏反應(yīng)和結(jié)石癥最為嚴(yán)重。頭孢曲松為人用抗生素，目前已被農(nóng)業(yè)部列為禁止用于動(dòng)物飼養(yǎng)過程的人用藥品。
　　目前檢測(cè)頭孢類抗生素殘留可采用理化檢測(cè)法、微生物檢測(cè)法和免疫學(xué)檢測(cè)法。理化檢測(cè)法所需儀器設(shè)備價(jià)格昂貴、專業(yè)技術(shù)性強(qiáng)及前處理過程繁瑣，以上因素決定了此法并不適用于基層

2、大量樣品的檢測(cè)。微生物檢測(cè)法具有細(xì)菌培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng)、特異性不高、準(zhǔn)確度低等缺點(diǎn)。免疫學(xué)檢測(cè)法，以酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)為主，基于抗原抗體的特異性結(jié)合，其特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作方法簡(jiǎn)單，適用于大量樣品的篩選。
　　1.CTRX完全抗原的合成及鑒定。
　　本研究采用戊二醛法合成兩種完全抗原。完全抗原經(jīng)紫外光譜掃描及SDS-PAGE凝膠電泳分析鑒定，可以初步判定完全抗原偶聯(lián)成功。完全抗原經(jīng)免疫小鼠、細(xì)胞融合及ELISA測(cè)定，

3、最終證明兩種完全抗原制備是成功的。利用BCA法測(cè)得CTRX-BSA和CTRX-OVA蛋白濃度分別為5.5 mg/mL和5.0 mg/mL。
　　2.CTRX單抗制備。
　　采用常規(guī)免疫方案免疫BALB/c小鼠，免疫原使用人工抗原CTRX-BSA，ELISA檢測(cè)包被原使用CTRX-OVA。在小鼠五免后第7d尾靜脈采血，檢測(cè)血清抗體效價(jià)及其藥物抑制情況，血清效價(jià)達(dá)1∶16000以上。通過細(xì)胞融合技術(shù)、ELISA篩選方法和有限稀釋

4、亞克隆法獲得兩株可持續(xù)分泌針對(duì)CTRX單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為3E7和7A7。通過小鼠體內(nèi)誘生法制備腹水，共18 mL，BCA法測(cè)其蛋白濃度分別為20.93mg/mL和21.47 mg/mL;效價(jià)分別為32000和128000。采用HiTrap Protein GHP純化柱純化1mL7A7腹水，得到純化后的7A7腹水約5 mL，純化后的蛋白濃度為1.1 mg/mL，蛋白回收率為5.1％。SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果顯示，腹水

5、純化效果良好。交叉實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該CTRX單抗與頭孢氨芐、頭孢噻呋、頭孢拉定、頭孢噻肟、頭孢噻吩幾乎沒有交叉反應(yīng)，且對(duì)CTRX的抑制率為100％。
　　3.ELISA檢測(cè)方法的建立。
　　利用純化后的7A7腹水建立檢測(cè)CTRX殘留的CiELISA方法。包被原最佳稀釋濃度1∶3000，純化后7A7抗體的工作濃度1∶16000。CTRX濃度在1.72～2000 ng/mL時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。其線性方程為y=0.2541x-

6、0.0184(R2=0.9875)，IC50為108.68ng/L, LOD為1.72 ng/mL, LOQ為13.12 ng/mL。
　　4.豬肉中CTRX添加回收實(shí)驗(yàn)
　　使用豬肉進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，豬肉樣品經(jīng)過一系列前處理后用于實(shí)驗(yàn)測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示樣品處理液稀釋8倍以上時(shí)，基本可以消除樣品基質(zhì)的干擾。在20～1000 ng/mL藥物濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，線性方程為y=0.4466x-0.4738，相關(guān)系數(shù)R2=0.