抗人β2微球蛋白單克隆抗體的制備及ELISA檢測方法的初步建立.pdf

1、β2微球蛋白（β2-microglobulin，β2-MG）是由機(jī)體產(chǎn)生的一種內(nèi)源性低分子量血清蛋白質(zhì)，分子量11.8KD，是細(xì)胞膜上完整主要組織相容性復(fù)合物(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)Ⅰ類分子的輕鏈（β鏈），在免疫應(yīng)答中起重要作用。隨著代謝和MHC的降解，β2微球蛋白分離后以游離形式存在于血清、尿液、腦脊液、唾液等體液中，含量較低且恒定。近年來，β2微球蛋白在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)及臨床診斷上的應(yīng)用已成為

2、研究熱點(diǎn)，檢測血清或尿液中β2微球蛋白含量的變化成為評價(jià)相關(guān)臟器功能和某些疾病發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的重要指標(biāo)。β2微球蛋白的檢測方法主要有免疫比濁法、免疫透射比濁法、化學(xué)發(fā)光法等，其中酶聯(lián)免疫法因簡便、快速、敏感性高而備受臨床歡迎，而目前可應(yīng)用于臨床的ELISA試劑盒較少，因此研制一種快捷有效的ELISA檢測方法具有重要意義。
　　本研究以高純度的人β2微球蛋白作為免疫原，采用常規(guī)免疫和脾內(nèi)免疫相結(jié)合的方法免疫純系BALB/c小鼠，取

3、免疫脾細(xì)胞與對數(shù)期SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，間接ELISA法篩選陽性孔。經(jīng)3～4次克隆化、多次傳代及凍存后復(fù)蘇，共篩選獲得5株穩(wěn)定分泌抗人β2微球蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為2G7、2H2、3F9、5D10、8E12。經(jīng)鑒定，5株單抗亞型皆為IgG1類，腹水效價(jià)均在10-7-10-9之間，腹水經(jīng)Protein-A親和層析法純化后進(jìn)行電泳，結(jié)果顯示5株單抗純度良好。間接ELISA法和Westernblot鑒定單抗特異性，結(jié)果表明

4、5株單抗均能與人β2微球蛋白發(fā)生特異結(jié)合，而與人血清白蛋白、血紅蛋白、EB病毒基因工程抗原、支原體基因工程抗原無交叉反應(yīng)，證明5株單抗具有良好的特異性和反應(yīng)原性。
　　采用改良過碘酸鈉法分別對5株單抗進(jìn)行酶標(biāo)，經(jīng)抗體配對實(shí)驗(yàn)篩選出一對可用于雙抗體夾心ELISA的配對抗體，初步建立了β2微球蛋白雙抗體夾心定量ELISA檢測方法。經(jīng)方陣滴定實(shí)驗(yàn)確定了包被抗體最佳包被濃度為3ug/mL，酶標(biāo)二抗最佳工作濃度為1∶4000，該檢測方法線性

5、范圍為1.25～40ng/mL，最低檢出限為1.25ng/mL，批內(nèi)CV＜8％，批間CV＜12％，準(zhǔn)確度良好。用本研究建立的檢測方法檢測35份臨床血清標(biāo)本β2微球蛋白含量，與Roche公司的β2微球蛋白檢測試劑盒檢測結(jié)果相比，相關(guān)系數(shù)R2=0.9550，兩者具有良好的相關(guān)性。
　　本研究成功制備了抗人β2微球蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，初步建立了人β2微球蛋白雙抗體夾心定量ELISA檢測方法，為進(jìn)一步研制快速診斷試劑盒和其他檢測方