抗弓形蟲單克隆抗體的制備及夾心ELISA方法的建立.pdf

1、為建立弓形蟲病標準、準確、快速的免疫診斷體系及亞單位疫苗的研制，為弓形蟲抗原的分離和純化及探索弓形蟲的保護性免疫等研究提供適宜的工具，本研究利用經(jīng)淋巴細胞分離液密度梯度離心、微孔濾膜過濾、多次低速離心提純的弓形蟲速殖子，再通過反復凍融和超聲波處理后作為抗原免疫 Balb/c小鼠6次，獲得針對弓形蟲速殖子的抗體。間接 ELISA檢測結(jié)果顯示，6免后抗體效價均達到1：6400以上。
　　 本次建立的間接 ELISA方法，其主要條件如

2、下：0.5μg·mL-1的弓形蟲速殖子為包被抗原，1％牛血清白蛋白為封閉劑，1：5000稀釋 HRP標記羊抗鼠 IgG作為二抗，TMB(3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯)作為底物。實驗證明，該方法特異性強，有較好的重復性。用該法對弓形蟲速殖子免疫小鼠的血清抗體及其雜交瘤細胞單抗上清進行檢測，獲得滿意的效果。
　　 以 PEG2000為促融劑，取效價高的免疫小鼠脾細胞與 NSO骨髓瘤細胞融合。經(jīng)間接ELISA方法篩選陽性孔，有限稀釋法進

3、行3～4次克隆和亞克隆，獲得4株能穩(wěn)定分泌抗弓形蟲單克隆抗體的雜交瘤細胞株(3A3、3G3、4F4、4G3)，1株單抗腹水(3A3)。經(jīng)鑒定，4株雜交瘤細胞株的上清效價分別在1：800～12800之間，1株腹水(3A3)效價在1：51200，且穩(wěn)定性良好，單抗亞類為 IgG1，與豬等孢子球蟲、豬隱孢子蟲、豬旋毛蟲、豬蛔蟲等無特異性。采用免疫熒光法對腹水進行初步鑒定，發(fā)現(xiàn)均為抗速殖子單抗。單抗的腹水提純后進行 SDS-PAGE和 West

4、en-blotting分析，單抗的分子量均約為45kDa。用3A3A5單抗包板酶標板與豬抗弓形蟲抗體建立夾心 ELISA方法，單抗的最佳稀釋度為1：800，豬抗弓形蟲高免血清的最佳稀釋度為1：1OO～200。特異性試驗表明：該方法對于同屬于孢子蟲屬的豬等孢子球蟲、豬隱孢子蟲、豬旋毛蟲、豬蛔蟲有較高的識別力，其 OD450nm值則顯著偏低。該方法不受其它外界因素的影響，靈敏度高，特異性強，對于臨床診斷和公共衛(wèi)生學將是一種簡便、可靠的檢測方