流產(chǎn)衣原體MIP蛋白的雙抗原夾心ELISA診斷方法建立及單克隆抗體制備.pdf

1、流產(chǎn)衣原體（Chlamydia abortus，C.abortus）是一種嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性細(xì)菌，可感染妊娠母畜導(dǎo)致流產(chǎn)、死產(chǎn)或者弱胎等;也可引起公畜發(fā)生睪丸炎、尿道炎等癥狀;孕婦與感染的動(dòng)物直接接觸也會(huì)造成流產(chǎn)及全身感染等癥狀，因此流產(chǎn)衣原體是一種重要的人獸共患病病原。巨噬細(xì)胞感染增強(qiáng)蛋白(MacropHage Infectivity Potentiator，MIP)是一種脂蛋白，作為一種免疫顯性抗原，參與衣原體感染，引起炎癥

2、反應(yīng)等過(guò)程。
　　本研究以MIP為研究對(duì)象，利用GenBank已公布的序列，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增得到MIP蛋白的編碼基因，經(jīng)過(guò)酶切、連接、轉(zhuǎn)化將其插入原核表達(dá)載體pET30a(+)，成功構(gòu)建表達(dá)載體pET-mip并轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分析可見在27 kD處出現(xiàn)特異性條帶，表明插入的mip基因成功表達(dá);Western-blot特異性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表達(dá)的MIP蛋白具有反應(yīng)原性。
　　以純

3、化的MIP蛋白做為包被抗原，HRP標(biāo)記的MIP蛋白為酶標(biāo)抗原，最適包被濃度為2.5μg/mL，血清最佳稀釋度為1∶100，建立雙抗原夾心ELISA方法。建立的雙抗原ELISA與IHA相比，敏感性高，符合率為89.3％;與支原體、嗜肺軍團(tuán)菌、口蹄疫等陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng);批間、批內(nèi)CV％均小于11％，表明建立的雙抗原夾心ELISA方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好。
　　以純化的MIP蛋白免疫Balb/c小鼠后篩選陽(yáng)性細(xì)胞克隆并進(jìn)行有限

4、稀釋克隆化，建立了兩株能穩(wěn)定分泌抗MIP蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為M1和M3。間接ELISA法鑒定單抗上清抗體效價(jià)為1∶1600;染色體鑒定符合雜交瘤細(xì)胞的特性;兩株單抗50％最大結(jié)合濃度均為10μg/mL; Western-blot鑒定兩株單克隆抗體能特異識(shí)別MIP蛋白;Mouse單克隆抗體亞類檢測(cè)試劑盒鑒定2株單抗免疫球蛋白類型均為IgG1，輕鏈為κ鏈;雞胚接種鑒定2株單抗能有效中和衣原體感染性。
　　綜上所述，