(一)抗豬鼻支原體單克隆抗體的研制及雙抗體夾心ELISA檢測法的建立;(二)念珠狀鏈桿菌血清學抗原檢測方法的建立.pdf

1、豬鼻支原體(Mycoplasma hyorhinis)是豬鼻腔的常在菌，除了在自然條件下可引起豬的肺炎，近年來被發(fā)現(xiàn)其與人胃癌、大腸癌有高度相關性，已經(jīng)被認為是一種新發(fā)人傳染病的病原。由于缺乏簡單、快速的檢測方法，該病原在人群中的感染情況尚不清楚。因此，該病原檢測方法的研究將是流行病學研究的關鍵。
　　 血清學檢測方法以其靈敏度高、簡便快捷及費用相對低廉等各種優(yōu)點已經(jīng)廣泛用于病原微生物感染的實驗室診斷，尤其是直接血清學方法對于因

2、帶菌量少、血清抗體滴度較低的感染檢測具有較大的優(yōu)勢。因此，本研究從單克隆抗體研制著手，進而建立以檢測抗原為目的的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定試驗法(ELISA)，以期發(fā)展一種特異、敏感和快速的人豬鼻支原體感染的檢測方法。為此，我們從以下幾個方面進行了研究。
　　 首先，單抗的制備與鑒定。使用豬鼻支原體CVCC361(購自中國獸藥監(jiān)察所)株全菌抗原免疫BALB/c小鼠，經(jīng)細胞融合，用ELISA法篩選獲得.ZB1～ZB17共17個陽性

3、雜交瘤細胞株，其分泌抗體的效價最高達1：1.28×105以上，并與實驗動物常見的7種病原菌及11種支原體呈陰性反應；IgG亞類分別為IgG1、IgG2、IgG2b、IgG3；免疫印跡試驗顯示，ZB1、ZB2及ZB16與相對分子質量為35×103的抗原有特異性結合，而ZB3和ZB10與相對分子質量為70×103的抗原有特異性結合。
　　 其次，我們建立了以單抗為診斷抗體的雙抗體夾心ELISA法。采用最佳配對實驗，篩選出以單抗ZB1

4、作為包被抗體、ZB1、ZB2—辣根過氧化物酶標記(ZB1—HRP、ZB2—HRP)作為檢測抗體的配對，對豬鼻支原體抗原的檢測限均可達到ng級水平，可檢出最小抗原量為3.9ng/ML，檢出豬鼻支原體活菌8.34×102CFU/mL，與人呼吸道常見的致病微生物及11種支原體均無非特異性反應。
　　 綜上所述，本研究采用B淋巴細胞雜交瘤細胞技術成功地制備出了17株較高特異性和敏感性的抗豬鼻支原體單克隆抗體，并以其為診斷抗體建立起以檢測

5、抗原為目的的雙抗體夾心ELISA法，顯示了較好的特異性和敏感性。為人群豬鼻支原體流行病學研究提供了一種更可靠而便利的手段，并將對這一新發(fā)感染性疾病的研究，進而對人類腫瘤防控有重要的意義。
　　 念珠狀鏈桿菌是一種革蘭陰性，多形態(tài)細菌，可引起人鼠咬熱及哈佛山熱，其正常宿主為嚙齒類動物，對人類、實驗小鼠、非人靈長類等有極強的致病性，已經(jīng)被認為是動物試驗工作者的職業(yè)危害、是各國實驗動物必需排除的致病菌，也被世界衛(wèi)生組織列為人類新發(fā)傳染

6、病的病原菌。
　　 該病原菌細胞的形態(tài)和排列因環(huán)境條件及菌齡不同而差別極大，具有自動形成和保持L型的能力，對鏈霉素、青霉素、四環(huán)素較敏感。體外培養(yǎng)營養(yǎng)要求高，生長緩慢。
　　 由于念珠狀鏈桿菌特殊的生物學特性，決定了其在實驗動物質量常規(guī)檢測和人感染的實驗室診斷的困難性。病原學方法可能因該菌的變異性、特殊營養(yǎng)要求、生長緩慢、帶菌量少、形態(tài)變異等特性而呈陰性結果；分子生物學方法對該菌的檢測尚處于探索階段，在用于實驗動物常規(guī)檢

7、測時，沒有商品化的檢測試劑盒，難以確保檢測質量，此外，檢測成本也是限制該方法的一個重要因素；由于該菌在人和實驗小鼠感染后潛伏期短，發(fā)病急，間接血清學檢測方法也不適用。因此發(fā)展以檢測病原為目的的直接血清學方法具有十分重要的意義。
　　 本研究利用單克隆抗體技術，制備抗念珠狀鏈桿菌的特異性單抗，進而建立雙抗體夾心ELISA法，以期建立一種快速、高特異性、高敏感性和低成本的實驗動物質量常規(guī)檢測方法和人類念珠狀鏈桿菌感染的實驗室診斷方法

8、，并為進一步的病原學、流行病學研究提供技術儲備。為此，我們從以下幾個方面進行了研究。
　　 首先，對念珠狀鏈桿菌的變異性進行了觀察，以確定免疫原。對不同培養(yǎng)條件及培養(yǎng)時間的念珠狀鏈桿菌進行了動態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)時間及液體培養(yǎng)環(huán)境與固體培養(yǎng)基上菌體形態(tài)有明顯差異，電鏡結果顯示了細胞結構的變化，鏈狀形態(tài)的細菌有細胞壁缺失及膜成分的增厚。結果表明，48h液體培養(yǎng)物既有較典型的原型結構也有變異型，適宜作為免疫原免疫動物。
　　

9、 其次，單抗的制備與鑒定。選用48h液體培養(yǎng)物對BALB/c小鼠進行免疫，ELISA法篩選獲得SM1～SM16共16個陽性雜交瘤細胞株，其分泌抗體的效價最高達1：1×105；IgG亞類分別為IgG1、IgG2a；免疫印跡試驗顯示，SM6、SM7和SM8與念珠狀鏈桿菌在50×103相對分子質量處有反應條帶，SM9在35×103相對分子質量處有反應條帶。與不同形態(tài)的培養(yǎng)物的免疫印跡試驗顯示，SM9與肉湯及平皿培養(yǎng)物在35×103相對分子質量

10、處均有一條反應條帶，SM6、SM7和SM8僅與平皿培養(yǎng)物在50×103相對分子質量處有反應條帶；免疫熒光結果顯示，SM9與桿狀菌體反應較鏈狀菌體強烈，SM6、SM7和SM8則相反；同時，免疫電鏡結果顯示SM9主要與細胞壁發(fā)生反應，而SM6、SM7和SM8的反應主要發(fā)生在細胞膜上。
　　 進而，我們建立了雙抗體夾心ELISA法。最佳配對實驗篩選出SM9—SM6—HRP的最佳配對，檢測限為125ng/mL，活菌檢測限為12.1×10

11、2CFU/mL。與人呼吸道常見的致病微生物及支原體均無非特異性反應。可有效的檢測L型變異菌，檢測靈敏度與非變異菌無顯著差別。
　　 綜上所述，本研究采用B淋巴細胞雜交瘤細胞技術成功地制備出了16株抗念珠狀鏈桿菌單克隆抗體，通過ELISA法、免疫印染法和免疫電鏡方法確定了其特異性、敏感性、所結合抗原的相對分子質量，以及和菌體細胞的免疫結合點，以此為基礎建立了較高特異性和敏感性的雙抗體夾心ELISA法，并能有效地檢出L型變異菌。