抗雞IL-4單克隆抗體的研制及其雙抗體夾心ELISA方法的初步建立.pdf

1、IL-4是一種多效性T細胞源細胞因子，通過作用于不同類型細胞來調(diào)節(jié)宿主防御和宿主免疫。IL-4在調(diào)節(jié)T、B細胞分化及Th2型免疫反應(yīng)的發(fā)展中是必需的。此外，IL-4也是單核細胞和巨噬細胞激活的調(diào)節(jié)因子。 已有大量的文獻研究了人、小鼠、大鼠、豬等哺乳動物的IL-4基因及其生物學(xué)活性。在家禽中，因缺乏禽類相關(guān)的特異性試劑而阻礙了禽類IL-4的研究，本研究旨在以通過制備雞IL-4特異性單克隆抗體為基礎(chǔ)，初步建立雞IL-4雙單抗夾心EL

2、ISA方法，為家禽的免疫檢測、免疫細胞功能分析和免疫調(diào)節(jié)等方面的研究提供條件。 一、抗雞IL-4單克隆抗體的制備與鑒定 應(yīng)用淋巴細胞雜交瘤技術(shù)，用純化的重組蛋白rGST-ChIL-4免疫8周齡BALB/c小鼠，腹部皮下和腹腔免疫，100μg/只。首免時，抗原與等量弗氏完全佐劑混合乳化經(jīng)腹部皮下免疫；二免時抗原與等量不完全弗氏佐劑混合乳化經(jīng)腹部皮下免疫；三免時用抗原通過腹腔直接免疫；間隔為兩周；尾靜脈加強免疫不加佐劑的抗原

3、，100μg/只，3d后，取免疫鼠脾細胞和骨髓瘤SP2/0-Ag-14細胞進行融合。純化的rHis-ChIL-4作為檢測抗原，用間接ELISA方法篩選陽性克隆。獲得9株穩(wěn)定分泌ChIL-4的單克隆抗體細胞株，命名為16D8、17D7、18F7、18F12、19F1、20C9、20F2、20G3、6A8，它們的腹水效價依次為1，280，000、1，280，000、640，000、640，000、640，000、640，000、640，00

4、0、640，000、160，000、160，000，除16D8和20F2 McAb亞類為IgG2a外，其余均為IgGl。 試驗表明，所得單抗只與相應(yīng)的融合蛋白反應(yīng)，與其它融合蛋白和對照細菌不反應(yīng)，顯示良好的特異性。Western-blot試驗顯示所得單抗均能與相應(yīng)的融合蛋白發(fā)生反應(yīng)，出現(xiàn)特異性條帶。為雞體內(nèi)IL-4水平的檢測，作為某些疾病的檢測指標(biāo)，用于疾病的預(yù)防和控制，進行細胞免疫機理及細胞因子間相互作用方面的研究提供了有用的

5、材料。 二、雞IL-4雙單抗夾心ELISA方法的初步建立 通過對6株單抗抗體飽和度測定和相加指數(shù)測定進行初步篩選，采用20C9單抗以濃度為10μg/ml作為包被抗體，酶標(biāo)抗體bio-16D8作為檢測抗體建立抗體夾心ELISA方法，并摸索封閉液、稀釋液、抗原最佳反應(yīng)時間、酶標(biāo)抗體最佳工作濃度、反應(yīng)時間、HRP-streptavidin最佳工作濃度、反應(yīng)時間、底物最佳反應(yīng)時間等條件，對比試驗最終選擇含10％小牛血清的磷酸鹽緩