豬偽狂犬病毒單克隆抗體的研制及雙抗體夾心ELISA檢測(cè)病毒方法的建立.pdf

1、偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的多種家畜和野生動(dòng)物以發(fā)熱、奇癢及腦脊髓炎為特征的急性傳染病。該病在豬群多呈暴發(fā)流行，常引起妊娠母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，新生仔豬大量死亡，育肥豬發(fā)生嚴(yán)重的呼吸道癥狀和增重滯緩，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，建立有效的病原檢測(cè)方法對(duì)控制和消滅PR.具有重要意義。本研究研制了針對(duì)PRV的單克隆抗體，并利用單抗和多抗建立了檢

2、測(cè)偽狂犬病毒的雙抗體夾心ELISA(DAS-ELISA)方法。為PR的流行病學(xué)調(diào)查和快速診斷奠定了基礎(chǔ)。
　　 1.偽狂犬病毒單克隆抗體的制備
　　 PRV以PK15擴(kuò)增后通過蔗糖密度梯度離心法純化病毒。以200μg的純化病毒用弗氏完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射8周齡BALB/c小鼠；2周、4周后使用不完全佐劑乳化病毒后各免疫一次；6周后以純化病毒加強(qiáng)免疫，最后一次免疫3天后，取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合以獲得單克隆抗體

3、。用間接ELISA方法篩選陽性克隆，并用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，最終得到了4株能穩(wěn)定分泌抗PRV的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1A10、2E2、4E6、685，其中1A10、2E2的效價(jià)為1:51200，亞類為IgG2b，4E6、685的效價(jià)為1:12800，亞類為IgG1。4株單抗均與PRV分離株和疫苗株反應(yīng)，與PPV、PRRSV、PCV1、PCV2、CSFV均無交叉反應(yīng)，說明它們都具有良好的特異性。
　　 2.檢測(cè)偽狂犬

4、病毒DAS-ELISA的建立
　　 用純化后的PRV免疫家兔制備兔抗PRV的多抗血清。單抗腹水和多抗血清采用辛酸-飽和硫酸銨方法純化后，用于建立檢測(cè)PRV的DAS-ELISA。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)后確定最佳反應(yīng)條件，多抗作為捕獲抗體，包被量為590ng，單抗作為檢測(cè)抗體，檢測(cè)量為123ng，各步的最佳反應(yīng)時(shí)間為30min，顯色時(shí)間為15min。對(duì)建立的檢測(cè)方法進(jìn)行特異性鑒定，該方法與幾種豬傳染病病原(PPV、PRRSV、PCV1、PCV2