狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體的制備及應(yīng)用.pdf

1、狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies Virus, RABV）引起的人獸共患性疾病，危害性極大，一旦發(fā)病便引起100％的死亡率。RABV核蛋白（N）在各毒株間變異較小，是一種主要的保護(hù)性抗原，常作為診斷性抗原，用于狂犬病病原的檢測(cè)和病毒基因的分型。在RABV檢測(cè)中，目前雙抗體夾心ELISA法是用于RABV的定量檢測(cè)的主要方法，其特點(diǎn)在于檢測(cè)時(shí)間短，操作方便，成本低。因此，本研究針對(duì)RABV N蛋白制備單克隆抗體，并利用制備的單克隆抗體初步

2、建立雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法。
　　方法：本研究以SAD B19全病毒蛋白和原核表達(dá)的N蛋白作免疫原，對(duì)Balb/c小鼠進(jìn)行免疫，利用細(xì)胞融合技術(shù)建立能穩(wěn)定分泌抗N蛋白單克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞株。然后鑒定各株單克隆抗體的特性（亞類、特異性、抗原結(jié)合特性等），選用特性較好的單克隆抗體進(jìn)行大量制備與純化。
　　利用制備的單克隆抗體，確定雙抗體夾心ELISA方法中的捕獲抗體和檢測(cè)抗體。通過過碘酸鈉法對(duì)檢測(cè)抗體進(jìn)行辣根過氧化物

3、酶（HRP）標(biāo)記。以SAD B19全病毒蛋白作待檢抗原，通過方陣滴定法確定包被抗體與酶標(biāo)抗體的工作濃度，初步建立雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法，并檢測(cè)RABV。
　　結(jié)果：本研究成功制備七株抗SAD B19 N蛋白的單克隆抗體，分別命名為1A9、3G5、3F10、5B1、5D2、6A2、6G4，鑒定各株單抗的特性后確定：這七株單克隆抗體均為IgG類抗體，其中1A9、3G5、5D2三株的亞型為IgG1κ，3F10、5B1、6A2、6G

4、4四株的亞型為IgG2aκ；具有良好的特異性，能特異性識(shí)別B2c、CVS-24、DRV-AH-08、DRV-SX-15毒株，與其他幾個(gè)犬常見的病毒（犬細(xì)小病毒、犬瘟熱病毒、犬副流感病毒）不發(fā)生反應(yīng)；識(shí)別的抗原表位均為線性表位，并確定這七株單克隆抗體的抗原位點(diǎn)集中在N蛋白的C端區(qū)域，其中1A9、3F10、3G5、5B1、5D2、6G4的抗原位點(diǎn)在427~450位氨基酸間，6A2的抗原位點(diǎn)在384~405位氨基酸間；具有高親和力，親和常數(shù)均

5、在108 L/mol以上。
　　本研究通過配對(duì)實(shí)驗(yàn)確定3G5作捕獲抗體，包被濃度為2.5μg/mL；6A2作酶標(biāo)抗體，稀釋倍數(shù)為1:500。用建立的方法檢測(cè)B2c，確定建立的夾心ELISA檢測(cè)方法只能檢測(cè)結(jié)構(gòu)被完全被破壞的RABV病毒粒子（N蛋白被釋放出來）。
　　結(jié)論：本研究成功制備7株抗SAD B19 N蛋白IgG類單克隆抗體，特異性良好、親和力較強(qiáng)，為后期狂犬病病原的診斷提供了原材料。初步建立的雙抗體夾心ELISA法可