狂犬病病毒G蛋白的克隆表達(dá)及其V區(qū)特異性單克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus，RV)感染引起的致死性神經(jīng)紊亂傳染病。RV基因組為單股負(fù)鏈RNA，其具有五種結(jié)構(gòu)蛋白，分別是N蛋白，P蛋白，M蛋白，G蛋白和L蛋白。在五種結(jié)構(gòu)蛋白中，G蛋白在病毒結(jié)構(gòu)蛋白中具有重要地位，它存在于病毒表面，既是病毒的主要保護(hù)性抗原，又在病毒侵染宿主造成神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有重要作用，與病毒感染性直接相關(guān)。
　　本研究根據(jù)RV弱毒型LBNSE株G基因全序列，成功構(gòu)建了原核表達(dá)

2、載體pET-30a-G，用于完整表達(dá)RVG蛋白。重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-G轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)株BL21(DE3)中，利用IPTG誘導(dǎo)，并采用SDS-PAGE和Western blot兩種方法對(duì)其表達(dá)性進(jìn)行分析，結(jié)果一致性的在蛋白分子量67 KDa附近出現(xiàn)了蛋白大量表達(dá)的條帶，表明構(gòu)建的pET-30a-G重組質(zhì)粒正確表達(dá)G蛋白，大約為67 KDa，并且具有相應(yīng)的蛋白反應(yīng)原性，可用于后續(xù)研究提供研究基礎(chǔ)。
　　同時(shí)，本研究進(jìn)一步對(duì)

3、RV弱毒型LBNSE株與野生型IMDRV-13株的G蛋白進(jìn)行真核表達(dá)，并成功構(gòu)建了兩種不同真核表達(dá)載體pCAGGS-G/pCAGGS-13G。利用免疫熒光與RT-PCR的方法鑒定重組質(zhì)粒的表達(dá)情況，結(jié)果免疫熒光出現(xiàn)了特異性的熒光信號(hào)，RT-PCR鑒定出現(xiàn)了特異性的條帶，表明構(gòu)建的兩種真核重組表達(dá)質(zhì)粒具有正確表達(dá)G蛋白的能力。該研究成果可用于后續(xù)研究中鑒定McAb的識(shí)別位點(diǎn)提供研究基礎(chǔ)，并將為進(jìn)一步揭示RVG蛋白生物學(xué)功能提供研究基礎(chǔ)。<

4、br>　　為制備RVG蛋白特異性單克隆抗體(McAb)及鑒定其識(shí)別范圍，本研究采用人工合成多肽“PPDQLVNLHDFRSDEIEHLVVEE”與KLH的偶聯(lián)物免疫小鼠，經(jīng)篩選制備出一株陽性雜交瘤細(xì)胞，記作4D3，其亞類鑒定為IgG2b/κ鏈。利用構(gòu)建好的表達(dá)載體pCAGGS-G/pCAGGS-13G鑒定McAb的結(jié)合范圍。免疫熒光與Western blot分析顯示:該株McAb與真核表達(dá)的人工減毒株LBNSE G蛋白可發(fā)生特異反應(yīng)，而

5、與強(qiáng)毒株IMDRV-13 G蛋白不反應(yīng)。將免疫用多肽序列、毒株LBNSE相應(yīng)序列和強(qiáng)毒株IMDRV-13相應(yīng)序列相互比較，G蛋白的第264位氨基酸的改變直接影響該株McAb的結(jié)合，由于261位至264位氨基酸構(gòu)成G蛋白V區(qū)線性表位，可推測(cè)該株McAb可識(shí)別G蛋白V區(qū)線性表位。本試驗(yàn)結(jié)果可為進(jìn)一步研究G蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和毒株的初步篩查提供參考，為控制和消滅狂犬病做出相應(yīng)貢獻(xiàn)。
　　本實(shí)驗(yàn)室也設(shè)計(jì)了其他多肽序列的組合，正在進(jìn)行單抗的制