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文檔簡介
1、豬瘟(Classical swine fever,CSF)曾被稱為豬霍亂(Hog cholera,HC),俗稱“爛腸瘟”,是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病。研究表明,CSFV單克隆抗體不僅能為CSFV免疫機理等研究提供幫助,還使開發(fā)新型CSFV強弱毒的鑒別檢測以及CSFV同種屬病毒的鑒別檢測技術成為可能,因此,制備更高特異性及靈敏度的CSFV單克隆抗體
2、意義重大。
本研究首先根據CSFV石門株在PK-15細胞上的增殖規(guī)律,對CSFV石門株進行大量繁殖,并建立了穩(wěn)定性較高的CSFV檢測方法;隨后依次使用離心過濾、膜包超濾濃縮、Sepharose4Fast Flow過濾層析(4FF-SEC)等方法對CSFV進行純化。分別通過實時熒光定量RT-PCR技術、免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA)等對病毒純化效果進行評價。實時熒光定量RT-PCR結果證明病毒純化成功,并確定過濾層析后的
3、第一個收集峰為純化的CSFV;經IPMA測定病毒原液、超濾濃縮液、4FF-SCE純化病毒液的TCID50結果顯示,經超濾濃縮后,CSFV的TCID50/mL由最初的1047提升至106.5,病毒回收率約76.52%,超濾濃縮液經4FF-SEC進一步純化后,最終病毒回收率為63.2%。用上述純化的CSFV作為免疫原免疫6~8周齡BALB/c小鼠,隨后用大腸桿菌表達純化的CSFV E0-E2融合蛋白作為包被原,通過間接ELISA測定免疫小鼠
4、效價,免疫效價最高可達到1∶25600。
選取免疫效價較高的3號小鼠,取其脾臟與骨髓瘤細胞SP2/0進行融合;經ELISA方法篩選、2~3次亞克隆篩選、Western Blot鑒定后獲得5株可以與CSFV E0-E2融合蛋白特異性結合的陽性雜交瘤細胞株,分別命名為:5F2A7、5F2C12、8D4G7、9A1C7、11D4B6。IPMA結果顯示,5株抗體均與病毒結合,其中,9A1C7與病毒結合能力最強,且不與牛病毒性腹瀉病毒(
5、Bovine viral disease virus,BVDV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、PCV2(Porcine circovirus type2,PCV2)發(fā)生反應。經鑒定,9A1C7具有穩(wěn)定分泌單克隆抗體的能力;單抗亞型為IgG2c,輕鏈κ型。將9A1C7雜交瘤細胞株接種小鼠腹腔制備腹水,通過正辛酸-硫酸銨法對收集
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