豚鼠氣單胞菌單克隆抗體及抗獨(dú)特型單克隆抗體的制備及鑒定.pdf

1、豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)是養(yǎng)殖及野生魚、蝦、蛙、甲魚等生物常見的細(xì)菌性病原體，可通過(guò)受損傷的皮膚及傷口感染上述生物，并可進(jìn)一步通過(guò)食物鏈感染人。此菌所致魚類等豚鼠氣單胞菌病具有流行廣、發(fā)病快、死亡率高等特點(diǎn)，常常造成養(yǎng)殖漁業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重危害漁業(yè)及其它水產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)豚鼠氣單胞菌魚病的研究多局限于病原微生物學(xué)方面，對(duì)該病的診斷主要依靠臨診病理觀察及細(xì)菌學(xué)鑒定，兩種方法在準(zhǔn)確性及檢測(cè)速度上均有一定限

2、制；防治方面主要利用抗生素或減活、滅活疫苗，安全性和有效性均不理想。鑒于此，本研究設(shè)計(jì)制備抗豚鼠氣單胞菌單克隆抗體并進(jìn)而制備其獨(dú)特型單克隆抗體，為豚鼠氣單胞菌病的檢測(cè)及防治提供新的技術(shù)方法，并為其它魚用疫苗的研制提供參考。具體實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下： (1)通過(guò)動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、篩選、克隆化及利用ELISA檢測(cè)技術(shù)，制備并鑒定抗豚鼠氣單胞菌的單克隆抗體(mAb)。共得到7株能穩(wěn)定分泌mAb的細(xì)胞株，分別命名為：0E10、1A2、1

3、C4、1F1、1F10、1H8和2A1。染色體鑒定結(jié)果7株細(xì)胞染色體均符合雜交瘤細(xì)胞染色DepartmentofHistologyandembryology,FMMU,Xi'an第4頁(yè)體特點(diǎn)。雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)上清液及BALB/c小鼠腹水中mAbs效價(jià)范圍為1×10-2～1×10-3和1×10-3～1×10-5，亞類鑒定顯示：1F1屬于IgG1，1C4、1F10和1H8屬于IgG2a，2A1屬于IgG2b，0E10和1A21屬于IgG3,

4、交叉實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各株單克隆抗體與氣單胞菌屬內(nèi)另兩種常見致魚病性細(xì)菌嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌，以及其他四種常見致魚病性細(xì)菌鰻弧菌、遲緩愛德華菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌等均不發(fā)生交叉反應(yīng)，表明所制備的各株單克隆抗體均具有較好的特異性，可用于豚鼠氣單胞菌的檢測(cè)及進(jìn)一步研究。 (2)利用自制的單抗作為一抗，通過(guò)免疫組織化學(xué)SABC法對(duì)涂于玻片上的豚鼠氣單胞菌進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示：豚鼠氣單胞菌菌體呈稍彎的短桿狀，兩端鈍園，菌體周圍

5、呈深棕色，中央不著色，陰性對(duì)照呈陰性反應(yīng)。上述結(jié)果說(shuō)明自制的單抗針對(duì)的是豚鼠氣單胞菌的表面抗原，利用自制的單抗通過(guò)免疫組織化學(xué)染色方法可特異性地檢測(cè)豚鼠氣單胞菌。 (3)以豚鼠氣單胞菌感染龍睛蝶尾金魚為模型，對(duì)制備的5株抗豚鼠氣單胞菌單抗的治療保護(hù)效果進(jìn)行研究。結(jié)果表明：?jiǎn)慰?F1能提高受10LD50劑量豚鼠氣單胞菌感染金魚的存活率，其保護(hù)率為62.50％，對(duì)金魚具有明顯保護(hù)效果。上述結(jié)果提示單抗1F1所針對(duì)的可能是豚鼠氣單胞菌

6、的中和性抗原表位，具有免疫中和或減弱細(xì)菌毒性的作用，可用作魚類豚鼠氣單胞菌感染的中和性抗體治療制劑，也可作為制備豚鼠氣單胞菌抗獨(dú)特型抗體的理想候選單克隆抗體。 (4)利用自制的具有免疫中和活性的抗豚鼠氣單胞菌單克隆抗體1F1，通過(guò)動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、篩選和克隆化，獲得4株分泌抗獨(dú)特型抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1E12、4F6、6G6和7C1。雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)上清液及BALB/c小鼠腹水中抗獨(dú)特型抗體效價(jià)范圍 Dep

7、artmentofHistologyandembryology,FMMU,Xi'an第5頁(yè)分別為1×10-1～1×10-2和1×10-3～1×10-4。ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：4株抗獨(dú)特型抗體與兔抗豚鼠氣單胞菌多克隆抗體的結(jié)合都能被豚鼠氣單胞菌抑制，而且抑制百分率隨著豚鼠氣單胞菌濃度的增加而增加，說(shuō)明4株豚鼠氣單胞菌抗獨(dú)特型單克隆抗體與豚鼠氣單胞菌之間存在相互競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，均具有模擬豚鼠氣單胞菌抗原的特性。抑制百分率結(jié)果顯示6G6受

8、抑制程度比其余3株受抑制程度高，推測(cè)其模擬豚鼠氣單胞菌抗原的活性最好。生物學(xué)功能鑒定結(jié)果表明，制備4株豚鼠氣單胞菌抗獨(dú)特型單克隆抗體腹水的BALB/c小鼠血清均能與豚鼠氣單胞菌反應(yīng)，效價(jià)為1∶50～1∶800，說(shuō)明上述小鼠血清中含有抗豚鼠氣單胞菌抗體，提示4株豚鼠氣單胞菌抗獨(dú)特型單克隆抗體均具有模擬豚鼠氣單胞菌抗原表位的作用，可用作預(yù)防魚類豚鼠氣單胞菌病的疫苗。 綜上所述，本研究利用雜交瘤技術(shù)制備出多株抗豚鼠氣單胞菌的單克隆抗體