溫和氣單胞菌單克隆抗體的制備及初步應(yīng)用.pdf

1、溫和氣單胞菌是廣泛存在于水體中的致病菌，能單獨(dú)引起魚類發(fā)病或與嗜水氣單胞菌共同引起魚類的敗血病，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。迅速、準(zhǔn)確地診斷疾病，檢測(cè)出該病原菌，是防治該菌感染的關(guān)鍵。目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)魚類細(xì)菌性病原主要依賴于細(xì)菌培養(yǎng)鑒定和PCR檢測(cè)，這兩種方法均需要專業(yè)人員操作，操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)，成本比較高，不便于在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)利用雜交瘤技術(shù)制備了5株可穩(wěn)定分泌抗溫和氣單胞菌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，對(duì)其進(jìn)行鑒定、純化：在此基礎(chǔ)上

2、建立了檢測(cè)溫和氣單胞菌的單抗膠體金試紙條法，從而達(dá)到快速、簡(jiǎn)單、方便檢測(cè)溫和氣單胞菌的目的。 首先，以AS免疫Balb/C小鼠，四免后以AS包被酶標(biāo)板，用間接ELlSA法檢測(cè)小鼠血清。尾靜脈注射加強(qiáng)免疫后取效價(jià)最高的小鼠的脾臟細(xì)胞，利用50[％] PEG 4000將其與SP2/O細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，制備雜交瘤細(xì)胞。經(jīng)過(guò)對(duì)培養(yǎng)上清的篩選和雜交瘤細(xì)胞的克隆化，最終得到5株能分泌AS抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為：1A4、2C7、3G9

3、、3D5和2G3。對(duì)制備的5株雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行特異性鑒定，結(jié)果顯示2G3、1A4只與溫和氣單胞菌發(fā)生反應(yīng)，與它參考菌株無(wú)反應(yīng)，具有較強(qiáng)特異性。經(jīng)單抗亞類試劑盒測(cè)定，3株單克隆抗體2G3、1A4和3G9蛋白均為lgG，亞類分別為：IgG2<,b>，lgGl，lgGl。間接ELISA測(cè)定2G3、1A4腹水效價(jià)分別為1×10<'6>、1×10<'4>。相加試驗(yàn)表明兩株單抗2G3、1A4分別識(shí)別不同的抗原表位。兩株單抗2G3和1A4的相對(duì)親和力分

4、別為1.72×10<'8>mo·L<'-1>、5×10<,8>mol·L<'-1>。結(jié)果表明，獲得的兩株單抗2G3和1A4效價(jià)高，親和力強(qiáng)，具有較高特異性。這兩個(gè)單抗可用于溫和氣單胞菌的臨床檢測(cè)，同時(shí)可用于溫和氣單胞菌抗原檢測(cè)方法的建立。辛酸沉淀法和DEAE-纖維素法純化單抗2G3，1A4腹水后，測(cè)得其蛋白含量分別為8.58m/mL和5.86mg/mL。本實(shí)驗(yàn)利用制備所得單抗1A4標(biāo)記20nm膠體金，標(biāo)記膠體金穩(wěn)定。將單抗2G3、羊抗鼠